魏杰;王志国;朱诚;潘振华
美宏互动【摘 要】Objective Using the single chain fragment variable (scFv) fluorochrome conjugates to establish a probe, which can target human epidermal growth factor receptortype 2(HER-2)positive breast carcinoma in vitro and vivo.Methods The new scFv was obtained by overlapping PCR between variable region of heavy chain from patented Trastuzumab, G4S linker and variable region of light chain.And Pichia pastoris was used to express anti-HER-2 scFv.The binding activity of anti-HER-2 scFv to breast carcinoma cell line MDA-MB-453 was detected by flow cytometry.The in vitro targeting prosperities of anti-HER-2 scFv to breast cancer cell line MDA-MB-453 was detected by laser confocal microscope through linking anti-HER-2 scFv with alkaline dye Rhodamine B.MDA-MB-453-bearing nude mice model was established to evaluate the targeting activity of anti-HER-2 scFv in vivo.CCD camera was used to image the dynamics of anti-HER-2 scFv conjugated near infrared dye IRB-NHS in vivo.Results The target protein anti-HER-2 single chain fragm
ent variable was purified from culture supernatants by nickel affinity chromatograph, followed by analysis on Western blot.Furthermore, anti-HER-2 scFv maintained binding activity to MDA-MB-453 and the binding ratio was 47.4%.From the in vitro targeting experiment anti-HER-2 scFv can target MDA-MB-453 in vitro.And the average fluorescence intensity of anti-HER-2 scFv was 101.68±5.76, which better than that of blocking group(25.95±7.32).As anticipated, scFv maintained effective in vivo targeting using near infrared (NIR) imaging in MDA-MB-453 xenografts.And the tumor to normal tissue ratio of scFv was 4.96±0.38, which was better than blocking group(1.12±0.41).Conclusion We established and expressed anti-HER-2 scFv, which maintained the binding activity toparent antibody.Anti-HER-2 scFv has a desirable targeting activity in vitro and vivo.This ability may beused in the field of HER-2 positve breast cancer detection and has potential in clinical application.%目的 探讨使用单链抗体偶联荧光染料的手段构建一种探针,用它进行人类表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌的体内外检测.方法 通过Overlap PCR (polymerase chain reaction)的方法和柔性肽G4S将赫赛汀(曲妥珠单抗)的轻链与重链连接,构建工程载体,并通过毕赤酵母进行表达纯化,获得靶向
HER-2的单链抗体;流式细胞术检测单链抗体对HER-2阳性乳腺癌细胞MDA-MB-453的结合能力;将单链抗体与碱性荧光染料罗丹明B偶联,使用激光共聚焦检测单链抗体在体外对MDA-MB-453细胞的靶向能力;将单链抗体与近红外荧光染料NIRB-NHS偶联,通过CCD照相机实时收集荧光信号,检测偶联探针在荷瘤裸鼠体内的靶向能力,并判断其开发为检测试剂的潜力.结果 通过基因工程手段和毕赤酵母表达,成功获得抗HER-2单链抗体,经Western blot鉴定表明单链抗体anti-HER-2 scFv表达及装配正确.流式细胞术检测anti-HER-2 scFv与乳腺癌细胞MDA-MB-453的结合率为47.4%.体外靶向性实验验证单链抗体anti-HER-2 scFv可在体外很好地靶向乳腺癌细胞MDA-MB-453,单链抗体组的细胞平均荧光强度为101.68±5.76,明显优于阻断对照组25.95±7.32.体内近红外成像实验中,通过对荷MDA-MB-453细胞移植瘤裸鼠给药后的荧光信号分析,结果显示单链抗体探针可以很好靶向至肿瘤部位,分析热点区域的最大肿瘤/正常组织荧光信号比可知,单链抗体组的信号比为4.96±0.38,明显强于阻断对照组1.12±0.41.结论 采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了单链抗体anti-HER-2 scFv.单链抗体保留了母本抗体的结合能力,并体现了很好的体外和体内的靶向能力,其具有应用于HER-2阳性乳腺癌检测的潜在价值.
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2017(024)006
【总页数】5页(P647-650,654)
【关键词】人类表皮生长因子受体2(HER-2);乳腺癌;单链抗体;激光共聚焦;近红外成像
【作 者】魏杰;王志国;朱诚;潘振华
【作者单位】上海梅山医院检验科,江苏 南京 210039;江苏省中西医结合医院检验科,江苏 南京 210028;上海梅山医院检验科,江苏 南京 210039;上海梅山医院检验科,江苏 南京 210039中华人民共和国户口登记条例
【正文语种】中 文
乳腺癌是女性较为常见的肿瘤类型和死亡原因，据统计，全球近135万女性罹患乳腺癌，而乳腺癌致死人数也达到33万之多［1-2］。如今对于乳腺癌的最为有效的手段仍然是手术切除和化疗、放疗、内分泌的联合。但当乳腺癌病情发展到一定的程度，乳腺癌就会发生转移，如骨转移、血行转移、淋巴转移等；如果乳腺癌发生转移，说明乳腺
癌比较严重，已经到了中晚期；一旦发生转移，临床的难度极大增加，预后较差［3］，故早期检测具有重要意义。人类表皮生长因子受体2是一种穿膜蛋白，其具有酪氨酸激酶活性，并且是表皮生长因子受体家族的成员［4］。临床研究表明，近30%的乳腺癌患者高表达HER-2基因。基于HER-的高表达，基因泰克研发出赫赛汀（曲妥珠单抗，Trastuzumab）成为HER-2阳性乳腺癌检测的常用试剂［5-7］。
近年来，成像相关的技术迅速发展，使医学与生命科学交叉应用的关键科学技术——医学影像学成为临床检测的研究重点。随着荧光成像技术逐渐发展，其在细胞成像、心血管成像、近红外荧光分析、微量生物活性物质检测等生物医学工程领域得到广泛应用［8-9］，尤其在肿瘤成像领域有着很好的应用前景。本实验以HER-2为靶点设计了单链抗体，并将单链抗体与荧光染料结合，制备成HER-2阳性肿瘤的靶向探针［10］，为实验室研究或临床检测提供新的手段与技术。
罗丹明B荧光染料购自上海碧云天公司；活性近红外荧光基团（NIRB-NHS）试剂盒购自上海科远迪生物科技有限公司；DMEM培养基购自美国Invitrogen公司；蛋白 Marker购自美国热电公司；FITC偶联的羊抗鼠IgG-Fc单克隆抗体购自南京赛博生物公司；胎牛血清FBS
购自美国Invitrogen公司；Balb/c裸鼠购自扬州大学动物中心；（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）购自南京晚晴公司；细胞培养瓶及相关培养耗材购自美国热电公司。
2.1 融合蛋白表达及纯化 通过Drug Bank数据库搜索赫赛汀轻链与重链可变区蛋白序列，使用G4S柔性肽将两者连接在一起，并通过毕赤酵母偏爱密码子优化后送公司合成。导入工程质粒中。采用毕赤酵母X-33表达系统。发酵液经硫酸铵沉淀法初步提取后采用镍柱进一步分离纯化得到电泳纯蛋白，最后利用Western blot对纯化得到的蛋白进行鉴定，以期获得高产量高纯度的融合蛋白。
边际效应2.2 流式细胞术测定抗体与抗原结合 制备MDA-MB-453单细胞悬液，细胞数在106个/组。分为单链抗体组和脱脂牛奶空白对照组。在每组中分别加入250μL相应的抗体或脱脂牛奶，抗体浓度为200μg/mL，冰上孵育1h，洗涤，孵育鼠抗 His抗体，洗涤，再孵育FITC-偶联的羊抗鼠IgG抗体，洗涤，上机检测。使用FlowJo 7.6.1对流式数据进行处理。
2.3 激光共聚焦体外成像实验 取罗丹明B4.79mg溶于1mLPBS（pH为7.2）中，加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），摩尔比罗
丹明 B∶EDC∶NHS＝1∶1.1∶1.2，避光反应 4h，活化。反应后溶液再加入一定量的单链抗体，摩尔比罗丹明B∶scFv＝1∶1.2，继续避光搅拌反应，6h后停止反应得到产物粗品。使用超滤管纯化，5000r/min离心10min。将1mL罗丹明B-scFv加入到已培养24h的MDA-MB-453细胞中，37℃孵育2h，用PBS洗2遍即可使用激光共聚焦观察内吞情况。
2.4 近红外体内成像实验 本实验分为两组，分别是实验组为anti-HER-2 scFv组，另设置一个探针封闭组（Blocking组）。首先制备NIRB-anti-HER-2 scFv荧光探针，将1mg NIRB-NHS粉末溶于100μL的DMSO中，浓度为0.01mg/μL；将配置好的染料立即逐滴加入保存于含有anti-HER-2 scFv（浓度为10mg/mL）的PBS缓冲液中，放至摇床室温反应2h；反应结束后，将反应液加入超滤管中进行超滤，4000r/min离心30min，重复3次，取超滤管上层溶液，冻干可得到标记IRB的相应固体粉末。Blocking组是将荧光探针NIRB-anti-HER-2 scFv与anti-HER-2 scFv按物质的量1∶50混合制备Blocking组探针，终浓度为50μmol/L。建立MDA-MB-453荷瘤小鼠动物模型，收集对数生长期MDA-MB-453细胞，1000r/min离心3min后用生理盐水重悬，调整细胞密度为5×106个细胞/mL，取200μL细胞悬液接种于裸鼠右侧腋皮下。待肿瘤体积接近80mm3，经尾静脉注射实验组探针及Blocking组探针100μL。注射后0、4、8、12h后，分别对2组小鼠进行近红外成像拍照。使
用CCD照相机实时收集荧光信号，实验结果拍照并分析。
第九届中国网络视听大会
网络学习系统应用SPSS 20软件进行作图分析。不同组间比较采用卡方检验；计量资料采用均数 ±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
采用PCR技术将赫赛汀轻链与重链可变区蛋白序列通过G4S柔性肽连接在一起并导入工程质粒中，毕赤酵母X-33进行表达。经过硫酸铵沉淀法和镍柱纯化得到单链抗体 anti-HER-2 scFv，并进行Western blot验证（如图 1A），anti-HER-2 scFv的分子量为28kD。获得了纯度较高且装配正确的单链抗体anti-HER-2 scFv。
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