焦艳;李凌冰;牟燕;徐巍
【摘 要】目的：制备载他克莫司的口服复合物胶束，观察其理化性质及体外释药特征。方法采用薄膜超声法以普朗尼克 F127-壳聚糖聚合物（F127-CS）和脱氧胆酸钠（DCA）为材料制备他克莫司口服大分子复合物胶束，采用单因素考察和均匀设计筛选最优制备工艺；透视电镜下观察胶束外观形态，激光散射粒度仪测定粒径、Zeta 电位， HPLC 法测定载药量，荧光探针法测定临界胶束浓度，用动态膜透析法测定其在人工胃液和肠液中的体外释放情况。结果电镜照片显示，他克莫司口服胶束圆整均匀、不粘连，粒径为（55．77±2．23）nm，Zeta 电位为（－6．38±0．47）mV，载药量为8．93％±0．20％，临界胶束浓度为2．65×10－3 mol／L。体外释放结果显示，他克莫司 F127-CS ／DCA 胶束在人工肠液中的释放速率高于人工胃液。结论 F127-CS ／DCA 口服胶束具有较高的载药量和 pH 依赖释放特性，适合作为他克莫司口服给药系统。%Objective To prepare the Tacrolimus-loaded polyion complex micelles and observe their release charac-teristics in vitro.Methods Tacrolimus-loaded polyion complex micelles were prepared by film-ultrasonic method with Plu-ronic F127-chitosan (F127-CS)polymer and sodium deoxycholate (DCA).Preparation technique and optimal formulation were selected via single factor investigation and uniform design.Morphology of polyion micelles was observed by transmis-sion electron microscope.Diameter distribution and zeta potential of polyion micelles were measured by using laser size scattering determinator.Drug loading capacity (DL%)was determined with the high performance liquid chromatography (HPLC).Pyrene as a fluorescence probe was used to detect critical micelle concentration (CMC).In vitro release was e-valuated with dynamic membrane dialysis.Results The electron microscope showed spherical micelles were round and u-niform.The average diameter was (55.77 ±2.23)nm,zeta potential was (-6.38 ±0.47)mV,drug loading capacity (DL%)was 8.93% ±0.20%,and the Critical Micelle Concentration (CMC)was 2.65 ×10 -3 mol/L.In vitro release study suggested that Tacrolimus-loaded F127-CS /DCA micelles showed a pH-dependent release,the release rate in artifi-cial intestinal juice was higher than that in artificial gastric juice.Conclusion F127-CS /DCA polyion micelles have high drug-loading capacity and pH-dependent release characteristics,and are suitable for oral administration of Tacrolimus.
凌家滩【期刊名称】《山东医药》
半导体学报【年(卷),期】2016(056)042
【总页数】4页(P28-31)
【关键词】他克莫司;复合物胶束;普朗尼克F127-壳聚糖;制备工艺;体外实验
【作 者】焦艳;李凌冰;牟燕;徐巍
【作者单位】山东大学药学院，济南 250012;山东大学药学院，济南 250012;山东省千佛山医院;山东省千佛山医院
【正文语种】中 文
史迪威事件
【中图分类】R944.9
他克莫司(FK506)作为第2代免疫抑制剂广泛用于抗移植排斥[1]，因其具有不溶于水的性质，严重限制了其胃肠道吸收，口服吸收个体差异很大。口服FK506胶囊剂，肝移植患者
平均生物利用度(F)约22%、肾移植患者约20%、健康志愿者仅15%。FK506在血液中与红细胞、血浆蛋白和淋巴细胞的结合率分别为85%、14%、0.5%[2]。因此，克服其水溶性低、增加口服吸收是一个重要课题。胶束是近年来给药系统领域研究的一个热点，特别是聚电解质复合物胶束。它是由带电的亲水共聚物与带相反电荷的疏水化合物通过正负电结合形成的纳米制剂。其中疏水链构成内核，疏水物可包裹到胶束内核中，增加其在水中的溶解度[3]。脱氧胆酸钠(DCA)是胆酸盐的一种,对疏水物能起到增溶效果[4]。普朗尼克F127(F127)是两亲性嵌段共聚物，因其特有的生物相溶性，已获FDA批准作为药用辅料[5]。壳聚糖(CS)是几丁质的脱乙酰产物。作为自然界存在的惟一一种碱性多糖，其具有安全性、可微生物降解性、生物相容性等特点，加之其来源广泛及CS衍生物制备简单，使其作为药物缓控释材料得到广泛研究[6]。2015年3～12月，我们制备带正电荷的F127-CS聚合物[7]，与DCA通过正负电结合，将疏水药物FK506包裹，制备胶束；并利用均匀设计优化工艺，对其各项理化性质和体外释放特征进行了观察。 1.1 仪器与试剂 RG-18磁力搅拌器(上海玛尼仪器设备有限公司)；AV400核磁共振谱仪(Bruker公司, 瑞士)；傅立叶变换红外光谱仪(日本岛津公司)； FD1A-50 冷冻干燥机(上海豫明冷冻干燥机厂)。F127(BASF公司，美国)；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐
快乐在微笑中漫步
酸盐(EDC，Sigma-Aldrich公司，美国)；丁二酸酐 (上海化学试剂公司产品)；二甲亚砜、三乙胺(上海统亚化工科技发展有限公司)；CS(Mw≤3 000 Da，浙江金壳生物技术有限公司)；其他试剂均购自济南化学试剂有限公司，均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 F127-CS聚合物的制备[7] 取3.810 g纯化后的F127、0.045 g丁二酸酐、0.055 g二甲基氨基吡啶(DMAP)及0.060 g三乙胺，溶于1,4-二氧六环30 mL中，25 ℃下搅拌后避光反应24 h。圆底烧瓶收集反应后溶液，旋转蒸发除去有机溶剂，沉淀物用过量乙醚洗涤(重复3次)，25 ℃下真空干燥12 h，即得F127-COOH。将F127-COOH溶于PBS(pH 5)30 mL中，先加入0.087 g EDC，然后按照顺序加入0.052 g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1.35 g CS，25 ℃下搅拌后避光反应24 h。反应所得装入透析袋(Mw=6 000～10 000 Da)，室温重蒸水透析24 h，冻干，即得到F127-CS聚合物。所得产物结构通过红外光谱和1H-NMR光谱验证。
1.2.2 F127-CS/DCA载药胶束的制备 采用透析法制备[8,9]。称取15 mg DCA、8 mg FK506和15 mg F127-CS聚合物溶于适量甲醇中，装入透析袋中。用pH 6.5的蒸馏水透析2
4 h， 以3 000 r/min 离心30 min后，取上清液即得F127-CS/DCA胶束溶液[3]。
1.2.3 载药量和包封率测定 根据文献报道采用HPLC法测定胶束载药量[10]。仪器：Agilent高效液相谱仪；谱柱：ODS(DiamonsilTM C18,250 mm ×4.6 mm)；流动相：乙腈∶水∶H3PO4=70∶30∶0.1(V/V/V)；流速1.0 mL/min；柱温60 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。峰面积(A)与浓度(C)关系的标准曲线为C=0.000 32A-0.025 (R2=0.998 7)。将10 mg F127-CS/DCA FK506大分子复合物胶束溶液加于小试管中，用移液精密加入一定体积乙腈涡旋破解，超声完全溶解，微孔滤膜(0.22 μm)过滤；HPLC法测定，利用标准曲线计算FK506的浓度，进而计算出载药量和包封率。载药量=测量所得胶束内药物量/(载体材料量+测量所得药物量)×100%；包封率=胶束包裹的药物量/投药总量×100%。
湖北大学学报1.2.4 F127-CS/DCA胶束制备工艺的优化 采用均匀设计-效应面法优化制备工艺。选择F127-CS/DCA质量比(X1)、FK506投药量(X2)、透析样品体积(X3)、透析液温度(X4)以及透析时间(X5)进行优化筛选。每个因素选取4个水平，每个水平重复3次。按均匀设计U9(34)表安排实验，见表1。最优处方的验证：以载药量、粒径、Zeta电位为指标，制备3批F127-CS/DCA载药胶束，分别对其进行考察。
1.2.5 胶束外观形态观察 将胶束滴于电镜铜网上，1.5%的磷钨酸负染，透射电镜观察形态。
1.2.6 胶束的粒径分布及Zeta电位测定 采用激光粒度分布仪测定粒径大小及Zeta电位。
1.2.7 临界胶束浓度(CMC)测定 根据文献采用荧光探针法测定CMC[11,12]。将适量芘丙酮溶液转移到一系列刻度管中，氮气挥干。将系列不同浓度的空白胶束溶液加入到含芘丙酮的刻度管中，使芘丙酮的最终浓度为2.0×10-6 mol/L，摇匀，室温下平衡过夜。在激发光波长334 nm、发射光波长350～500 nm下测定荧光光谱，绘制发射图谱第1峰与第3峰的比例随聚合物浓度的变化曲线，从曲线拐点求CMC。
1.2.8 体外释放行为观察 采用膜透析法[13,14]。所用释放介质是含1%吐温-80的人工胃液和人工肠液，依据中国药典2015版第二部配制释放介质。分别吸取1.5 mL(含药500 μg)FK506注射剂，DCA胶束溶液及F127-CS/DCA胶束溶液置于夹紧一端的截留分子量为3 500 Da的透析袋中，小心排出气泡；夹紧另一端，放入50 mL含1%吐温-80的人工胃液(pH 1.2)及人工肠液(pH 6.8)中，100 r/min 37 ℃恒温水浴振荡。分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h取样2 mL，并补加等量温度相同的介质。采用HPLC法测定，依
据公式[13,14]计算累计释放百分率，绘制释放曲线。
2.1 F127-CS验证结果 红外光谱示，F127-CS聚合物出现了一个羰基伸缩振动峰，而F127和CS没有此峰,表明CS以酰氨键与F127连接[15]。F127-CS聚合物的1H-NMR光谱图中有F127、CS的特征峰，说明F127与CS成功联接。
2.2 F127-CS/DCA胶束制备工艺最优处方验证结果 均匀设计实验结果见表2。根据实验数据,选择载药量为指标，对各因素各水平进行二项式回归，确定F127-CS/DCA FK506大分子复合物胶束制备的最优处方为X1=1∶1、X2=8 mg、X3=25 ℃、X4=8 mL、X5=15 h。为验证最优处方的准确性和重复性，制备3批载药胶束，测定其载药量、粒径及Zeta电位，其预期结果分别为8.65%、56.40 nm、-6.54 mV，实际测量结果为8.93%±0.20%、(55.77±2.23)nm、(-6.38±0.47)mV。
2.3 胶束的外观形态、粒径、CMC 透射电镜照片可见，F127-CS/DCA胶束圆整均匀，成形良好，少有粘连，粒径为(55.77±2.23)nm。空白F127-CS/DCA胶束和空白DCA胶束的CMC分别在2.65×10-3 mol/L和1.8×10-2 mol/L。空白F127-CS/DCA胶束CMC显著降低，说明引入合成的F127-CS后，胶束的稳定性得到较好提升，具备更优良的抗体液稀释能力。
汽车可靠性试验
2.4 体外释放行为 在两种释放介质中，FK506注射液以近乎匀速缓慢释放，12 h累计释放量均不足40%；而F127-CS/DCA胶束和DCA胶束表现出先快后慢的释放特性。其中，在人工胃液中，F127-CS/DCA胶束的释放比在人工肠液中释放的慢，12 h累计释放量分别为58.74%±2.52%和81.73%±3.25%。见图1。
FK506是第二代免疫抑制剂中应用较为广泛的抗移植排斥药物。FK506具有不溶于水的性质，严重限制了其胃肠道吸收，且口服吸收有很大的个体差异。因此，提高溶解度是提高FK506口服制剂生物利用度的关键所在。
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