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www.ywfxzz www.ywfxzz ww.ywfxzz 药物分析杂志 Chinese 生物检定
商业部通知抗体偶联药物抗HER2单抗-MCC-DM1质控方法的建立* 李萌，于传飞，王文波，朱磊，刘春雨，张峰，陈伟，王兰**，高凯，王军志
（中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室，卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050）
摘要 目的：建立抗体偶联药物（ADC ）抗人表皮生长因子受体-2（HER2）单抗-马来酰亚胺基-环己
烷-1-羧化物（MCC ）-美登素衍生物（DM1）（trastuzumab-DM1，T-DM1）的质控方法。方法：利用人乳腺癌BT-474细胞增殖抑制实验测定T-DM1的生物学活性；利用生物分子间相互作用分析核心技术（biomolecular interaction analysis core-technology ，BIAcore ）测定其结合常数（K D ）；利用HER2抗原和抗DM1抗体双夹心酶联免疫法（ELISA ）对T-DM1进行鉴别；利用液质联用法和紫外分光光度法测定药物抗体偶联比（DAR ）；利用反相高效液相谱（RP-HPLC ）法测定游离药物DM1的含量；利用十二烷基磺酸钠-毛细管凝胶电泳（capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate ，CE-SDS ）和分子排阻谱（size exclusion-high performance liquid chromatography ，SE-HPLC ）分析纯度；利用成像毛细管等点聚焦电泳（iCIEF ）分析电荷异质性，其他各项指标均符合现行版中国药典的要求及其他相关要求。结果：T-DM1生物学活性相对效价为（94.04±2.60）%，K D 为（1.03±0.02）E-9 mol ·L -1，RSD 均小于5%；ELISA 鉴别为阳性；液质联用法和紫外分光光度法测得的DAR 分别为3.21及3.25；RP-HPLC 法测定游离药物DM1的含量为（0.822 2±0.050 5）%，RSD 小于10%；非还原CE-SDS 主峰面积为（96.63±0.07）%，RSD 为0.07%；SE-HPLC 主峰面积为（97.65±0.005 8）%，RSD 为0.005 8%；iCIEF 分析可以将每个偶联数的抗体药物分开，达到很好的鉴别。结论：建立ADC 中T-DM1质控方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点，为我国ADC
的质量检测提供了参考依据。关键词：抗体偶联药物（ADC ）；抗HER2单抗-MCC-DM1（T-DM1）；曲妥珠单抗；美登素；药物抗体偶联比；生物学活性；酶联免疫（ELISA ）；鉴别；纯度测定中图分类号：R 917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793（2016）01-0022-09doi ：10.16155/j.0254-1793.2016.01.04
Development of methods for quality control of an anti-human
epidermal growth factor receptor-2-MCC-DM1*
LI Meng ，YU Chuan-fei ，WANG Wen-bo ，ZHU Lei ，LIU Chun-yu ，ZHANG Feng ，
CHEN Wei ，WANG Lan **，GAO Kai ，WANG Jun-zhi
（Division of Monoclonal Antibodies ，National Institutes for Food and Drug Control ； Key Laboratory of the Ministry of Health for
Research on Quality and Standardization of Biotech Products ，Beijing 100050，China ）
杨昌济Abstract Objective ：To develop quality control methods of an anti-human epidermal growth factor receptor-2-MCC-DM1 （T-DM1），a kind of antibody-drug conjugate （ADC ）．Methods ：The bioactivity of T-DM1 was
* 国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目（No.2014ZX09304311-001，No.2012ZX09304010）；中国食品药品检定研究院学科带头人
培养基金课题（2013X3）
** 通信作者 Tel ：（010）67095707；Fax ：（010）67095954；E-mail ：
第一作者 Tel ：（010）67095706；E-mail ：lemon831115@163电磁泵
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Chinese evaluated by determining its cytotoxic effect on human breast cancer BT-474 cells ，the binding constant （K D ） was
evaluated by biomolecular interaction analysis core-technology （BIAcore ），T-DM1 was identified by enzyme-linked immune （ELISA ），the determination of drug antibody ratio （DAR ） was conducted by LC-MS and UV ，the determination of free drug DM1 was conducted by reversed-pha
se-high performance liquid chromatography （RP-HPLC ），and purity was analyzed by capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate （CE-SDS ） and size exclusion-high performance liquid chromatography （SE-HPLC ），and the charge heterogeneity was determined by imaged capillary isoelectric focusing （iCIEF ）．Results ：The relative potency of T-DM1 was （94．04±2．60）%，and K D was （1．03±0．02）E-9 mol ·L -1．It was identified as positive by ELISA ．The DAR was to be 3．21 and 3．25 respectively by LC-MS and UV ．The content of free drug DM1 was （0．822 2±0．050 5）%．The main peak area percentage showed by non-reduced CE-SDS was （96．63±0．07）%，the main peak area percentage showed by SEC-HPLC was （97．65±0．005 8）%．Antibody-conjugated drugs with different DAR can be separated effectively by iCIEF ．Other indicators were in line with the current edition of the Chinese pharmacopoeia and other related requirements ．Conclusion ：Methods for quality control of T-DM1 is developed ，which ensures the safety ，effectiveness and quality controllability of the product and provides a reference for quality control of domestic ADC ．Keywords ：antibody-drug conjugate （ADC ）；trastuzumab-DM1（T-DM1）；trastuzumab ；maytansine ；drug antibody ratio （DAR ）；biological activities ；enzyme-linked immune （ELISA ）；identification ；purity determination
胞因有丝分裂障碍而死亡的化合物，机制和长春碱
类药物相同，但活性是后者的20～100倍［12-13］。T-DM1既保留了曲妥珠单抗依赖性的细胞增殖抑制作用，同时又增加了潜在的细胞毒药物效应。由于DM1在肿瘤细胞内靶向释放，药物毒副作用并没有随着疗效的增加而同步增大，T-DM1的临床试验已经证实了其较好的抗肿瘤活性［14-15］。目前，国内也有多个企业针对HER2靶点开展ADC 的研发。
为了有效地对ADC 的质量进行控制，保证其安全、有效，本研究以T-DM1为目标产品，根据产品特征及关键质量属性，结合LC-MS 、BIAcore 、SE-HPLC 、CE-SDS 、iCIEF 等建立了该类产品ADC 的质控分析方法，为ADC 的质量控制提供了参考。1 材料与方法
抗HER2人源化单抗，DM1对照品、T-DM1样品及参比品均为中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留样。1.2 细胞
人乳腺癌细胞系BT-474由中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室保存、传代。1.3 主要仪器及试剂
Waters 公司的2690 System 高效液相谱仪，TSK G3000SWXL （300 mm ×7.8 mm ，5 μm ），Waters 公司Empower 分析软件。载体两性电解质
利用抗体实现细胞毒物靶向的观念可追溯到20世纪初［1］。近年来，随着基因工程技术、抗体制备技术的成熟，以及新型化学连接技术的出现，抗体-细胞毒物靶向这一技术取得了巨大的发展，并有多种药物实现了临床转化。早在2000年，抗体偶联药物（ADC ）Gemtuzumab ozogamicin （商品名Mylotarg ）就获得了FDA 的批准，用于老年人急性髓系淋巴瘤，然而其存在严重的安全隐患，并且无法证实患者的临床获益性，故于2010年6月退市［2］。2011年8月，ADC Brentuximab vedotin （商品名Adcetris ）通过FDA 批准，同时它也是近30年来首个FDA 新批准的用于霍奇金淋巴瘤的药物和首个用于罕见疾病系统性间变性大细胞淋巴瘤的药物［3］。2013年2月，另一个ADC Ado-trastuzumab emtansine （商品名Kadcyla ）获FDA 批准用于HER2阳性转移性乳腺癌［4］。这2个ADC 的上市，仅仅只是ADC 研究热潮的缩影，目前全球约80个ADC 处于研发阶段，已有超过35个ADC 进入临床试验阶段［5-6］。
抗HER2单抗-MICC-DM1（T-DM1）由抗HER2单抗（即曲妥珠单抗）和小分子微管类药物美登素衍生物（DM1）偶联而成［7-8］。2002年在我国上市的曲妥珠单抗是乳腺癌领域第1个也是应用最广的分子靶向药物，其适应症是HER2阳性的乳腺癌患者［9-11］。DM1是抑制微管蛋白聚合导致细
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Chinese Pharmalyte 3-10及8-10.5购自GE Healthcare 公司；iCE280试剂盒（包括1%、0.5%甲基纤维素，阳极及阴极电解液）、涂层毛细管、pI markers 7.05和9.22购自ProteinSimple 公司；尿素购自SeakyBio 公司。毛细管电泳系统为Beckman 公司的PA800 plus 系统；SDS-MW 分析试剂盒（含有0.1mol ·L -1氢氧化钠，0.1mol ·L -1盐酸，SDS 样品缓冲液，SDS-MW Gel Buffer ，货号390953）、Beckman 毛细管（50 μm ID ×65 cm ）均购自Beckman Coulter 公司。Waters 公司UPLC 串联Xevo G 2S 液质联用系统。SPECTRA M5酶标仪。GE 公司T200 BIAcore 生物大分子相互作用仪；N -羟基琥珀酸亚胺（NHS ）、N -乙基-二甲基-氨丙基碳二亚胺（EDC ）、乙醇胺-盐酸、人
源抗体捕获试剂盒、抗人Fc 抗体、HBS-EP 缓冲液、羧甲基化葡聚糖芯CM5传感芯片均购自美国GE Healthcare 公司。0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（GIBCO 公司，货号25200-056），胎牛血清（GIBCO 公司，货号10099-141），DMEM/F12培养基（GIBCO 公司，货号12400-024），细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8，日本东仁化学，货号CK04）。生物素化的HER2（由供样企业提供），醋酸钠（购自国药集团化学试剂公司，货号100187008），抗-Maytansine 抗体为本室留样。1.4 方法1.4.1 生物学活性测定对数生长期的BT-474细胞，经0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸
消化，以含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，调整细胞密度至1.5×105个•mL -1，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL 。用含10% FBS 的DMEM/F12培养基将样品从3.25 μg ·mL -1开始进行1∶2倍系列稀释，至0.013 μg ·mL -1，共9个稀释度，每一稀释度设2个复孔。将稀释好的样品转移至已接种BT-474细胞的培养板内，每孔50 μL ，混匀后置37 ℃、5% CO 2条件下连续培养。培养至第5天，每孔加入CCK-8
染液10 μL ，放入37 ℃、5% CO 2培养箱中，显
4 h ，用SpectraMax M5酶标仪读取450 nm 处的光密度值（OD ）。应用SpectraMax 四参数软件计算相对活性，相对活性=T-DM1参比品的IC 50/T-DM1的IC 50×100%。
1.4.2 亲和力测定
将抗人Fc 抗体用pH 5.0的10 mmol ·mL -1醋
酸钠溶液稀释至25 μg ·mL -1，通过氨基偶联法固
定于CM5传感芯片表面的第一通道和第二通道
（Flow cell 1和Flow cell 2），固定水平达到8 000 ~
10 000 RU 。T-DM1和T-DM1参考品用HBS-EP 缓冲液稀释至5 μg ·mL -1，以 5 μL ·min -1的流速捕获到第二通道（Flow cell 2），进样时间为30 s ，捕获水平达到120~130 RU 左右，第一通道不捕获相应的样品。将HER2蛋白用1X HBS-EP 缓冲液稀
释，
采用单循环动力学方法，进样时间120 s ，解离1 500 s 。分别进样浓度为1.2、
3.7、11.1、33.3和100 nmol ·L -1，并使用5个零浓度作为对照，再生条件为
3 mol ·L -1氯化镁溶液。重复上述样品3次，以测试样品和HER2蛋白的结合能力。获取表面等离子共振（surface plasmon resonance ，SPR ）数据传感图后，用Biacore T200 Evaluation Software （v2.0）打开，扣减对照后，用1∶1结合模型（1∶1 binding model ）以
全局拟合（global fit ）方式拟合数据，获取结合亲和力K D 动力学数据。1.4.3 ELISA 鉴别包被抗-DM1抗体4℃过夜，洗板6遍，用0.5%牛血清白蛋白室温封闭2 h ；将样品以64 ng ·mL -1为起始浓度2倍比稀释7个梯度，每孔加入100 μL ，室温孵育2 h ，洗板6遍，加入生物素化的HER2，室温孵育1 h ；洗板6遍，加入HRP-亲和素，TMB 显；450 nm 读数，并以参比品为对照计算样品的相对活性。1.4.4 游离药物测定
用甲醇将DM1对照品稀释5、3.5、2.5、1和0.5 pmol ·mL -1 5个浓度点分别进样10 μL ，制备标准曲线。样品DM1的提取：50 μL 样品空白（蔗糖-配方缓冲液：10 μmol ·L -1琥珀酸盐缓冲液、0.02%聚山梨醇酯20、60 mg ·mL -1蔗糖）/阳性溶液（取100 μL 含有蔗糖的均匀配方缓冲液和100 μL 的50 pmol ·L -1 DM1对照品溶液）/T-DM1对照溶液）/样品，加入甲醇100 μL ，冰浴30 min ，13 000 r ·min -1离心30 min ，取上清，每个样品做3次重复。液相谱
条件：进样量为10 μL ，进样器温度4 ℃，在252 nm 处检测；流动相为0.08% TFA 的乙腈溶液，流速为0.5 mL ·min -1，柱温35 ℃。采用RP-HPLC 法测定游离
药物DM1占偶联物总DM1的摩尔百分比。1.4.5 DAR 测定
1.4.5.1 样品的去糖化处理 对样品进行去糖基化处理（试剂盒购自Prozyme ，货号GKE-5003，含反应缓冲液、去垢剂溶液和PNGase ），将抗体偶联物200 μg 稀释于反应缓冲液45 μL 中，加入变性溶液
2.5 μL ；100 ℃变性5 min ，冷却至室温后加入去垢剂溶
液2.5 μL，然后加入PNGase （N-糖苷酶）2 μL，于37 ℃孵育过夜。
磺酸酯
1.4.5.2 液质联用分析 液相谱分析所用的谱柱为Waters公司的BEH300 C4分析柱（
2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相A为含0.1%甲酸的乙腈，流动相B为含0.1%甲酸的水，梯度洗脱（0~ 2 min，10%A→90%A，90%B→10%B），流速0.2 mL ·min-1，柱温80 ℃。质谱的采集范围为m/z 500~ 3 500，用Biopharmalynx软件对结果进行分析。
1.4.5.3 紫外可见光分析 将抗体偶联物用配方
缓冲液稀释至0.5 mg·mL-1，同时将配方缓冲液做同等比例稀释，以稀释后的配方缓冲做空白对照，在238～300 nm波长内对稀释后的抗体偶联物做吸收度扫描，并选取252 nm和280 nm的吸收度。
1.4.6 非还原CE-SDS
将样品用纯水稀释至1.0 mg·mL-1，将样品50 μL、SDS样品缓冲液50 μL、500 mmol·L-1碘乙酰胺5 μL混匀后，70 ℃水浴10 min，取75 μL置进样瓶中后上机分析。分离电压为15 kV，毛细管温度为和样品传送带温度均为20 ℃，检测波长为220 nm。
1.4.7 SE-HPLC
将样品用流动相稀释至1.0 mg·mL-1，进样量20 μL，进样器温度4 ℃，在280 nm处检测，流动相为0.2 mol·L-1的磷酸钾-15%的异丙醇，流速为0.5 mL·min-1，柱温25 ℃。采用面积归一化法计算单体百分比。
1.4.8 iCIEF
将样品用纯水稀释至10 mg·mL-1，将5 μL样品与70 μL的1%甲基纤维素，1 μL的pI marker 7.05，1 μL的pI marker 9.22，1.2 μL的Pharmalytes 3-10，6.8 μL的Pharmalytes 8-10.5，40 μL 8 mol·L-1尿素和75 μL超纯水混匀。分析条件为预聚焦电压1.5 kV，持续1 min；聚焦电压3 kV，持续10 min，样品管理器温度设置为8 ℃。
2 结果
2.1 生物学活性测定
CCK-8检测结果显示，3次T-DM1样品均存在量效关系，且符合四参数方程式：Y=（A-D）/［1+（X/C）B］+D，即在半对数坐标纸上呈典型的反S型曲线，相关系数在0.99以上，见图1。样品经重复检测3次，相对活性平均值在（94.04±2.60）%，RSD 均小于5%
。
图1 T-DM1样品体外增殖抑制活性的剂量反应曲线
Fig. 1 Dose-response curve of inhibition against proliferation in vitro of T-DM1
2.2 亲和力测定
应用BIAcore技术，将HER2抗原偶联在芯片上，测定T-DM1参比品、样品和裸抗的结合常数，两者之间的结合常数非常接近，如图2；样品经重复检测3次，测定K D平均值在（1.03±0.02） E-9 mol·
L-1，RSD均小于5%。
2.3 ELISA鉴别
TMB显检测结果显示，标准品结果存在量效关系，且符合四参数方程式：Y=（A-D）/［1+（X/C）B］+D，即在半对数坐标纸上呈典型的反S型曲线，相关系数在0.99以上，见图3。样品测得的百分效价为（97.96±2.79）%，RSD均小于5%，因而检定结果为阳性（当效价值在50%~150%范围内时，结论判断为“阳性”。当效价值<50%时，结论判断为“阴性”）。
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2.4 游离药物
游离药物DM1的检测结果见图4。根据DM1的标准曲线Y=2 854X+893.7（R2=0.996 9），测得样品游离药物DM1的含量。样品经3次实验检测，从而得到游离药物DM1/总DM1摩尔百分比为（0.822 2±0.050 5）%，RSD均小于10%。
2.5 DAR测定
2.5.1 液质联用法
对偶联前的抗体和去糖以后的偶联前抗体进行液质分析，结果如图5所示。由于抗体有多种糖基化修饰，在去卷积化后的质谱图上显示有多个峰（图5-A），而去糖后的抗体则主要显示为单峰（图5-B），相对分子质量为145 170.22，与理论值（去末端赖氨酸形式）145 167.36相比相差3左右，具有较好的精密度。
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RU
Adjusted sensorgram
70
50
30
10
-10
500
1 000
1 500
2 000
2 500
/
s
t 3 000Herceptin_1
Herceptin_2Herceptin_3T-DM1_1T-DM1_2T-DM1_3
T-DM1_Ref_1T-DM1_Ref_2T-DM1_Ref_3
图2 T-DM1样品BIAcore 测定结合动力学曲线Fig. 2 Binding dynamics curve of T-DM1 by BIAcore
图3 鉴别实验标准物质剂量反应曲线
Fig. 3
Dose-response curve of identification test of standard
图4 T-DM1（A ）和DM1对照品（B ）谱图
Fig. 4 Chromatograms of T-DM1（A ） and DM1 reference （B ）
利用液质联用法对T-DM1及去糖后的T-DM1进行分析，结果如图6所示。由于T-DM1本身具有糖型等异质性，加之偶联后药物的异质性，导致质谱图比较杂乱（图6-A ），很难判断其药物偶联的数目及分布。去糖后的质谱图则要简化很多（图6-B ），可用于药物偶联数目及分布分析。为了计算出DAR ，实验将D 0～D 8（包括其后的+1L 和+2L ）的峰强做加和，分别计算0～8个药物偶联分别所占
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