Vol.33高等学校化学学报No.82012年8月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1692~1697基于目标物诱导置换及纳米金催化的
刘雪平1,2，欧阳湘元1，吴会旺1，沈国励1，俞汝勤1
(1.湖南大学化学化工学院，化学生物传感与化学计量学国家重点实验室，长沙410082;2.河南城建学院环境与市政工程系，平顶山467036)摘要 在一定条件下，磁性纳米颗粒上修饰的腺苷核酸适体与纳米金标记的核酸探针杂交；再加入目标物腺苷诱导适体构象变换，并置换出金标探针；经磁场分离后，游离的金标探针进一步用于催化抗坏血酸还原铜离子，使铜离子对钙黄绿素的荧光猝灭得到抑制.由于极少量的纳米金能够催化大量铜离子还原并沉积在其表面，铜离子浓度急剧降低，从而改变钙黄绿素的荧光信号.实验结果表明，腺苷的动力学响应浓度范围为100pmol /L ~10nmol /L，检出限低至80pmol /L.核酸适体的高度特异识别性能保证了该方法具有良好的选择性. 关键词 纳米金；催化沉积；磁性纳米颗粒；核酸适体；荧光猝灭抑制
中图分类号 O657 文献标识码 A DOI :10.3969/j.issn.0251⁃0790.2012.08.011
收稿日期:2011⁃10⁃10.
基金项目：国家自然科学基金(批准号:21025521,21035001)和国家 九七三”计划项目(批准号:2011CB911000)资助.
联系人简介：俞汝勤，男，教授，博士生导师，中国科学院院士，主要从事化学生物传感与化学计量学研究.
E⁃mail:rqyu@hnu.edu 纳米金具有独特的物理和化学性质，如易制备㊁密度高㊁介电常数大以及良好的生物相容性等.它作为生物标记物在临床诊断㊁食品安全和环境监测等领域中应用非常广泛[1~4].纳米金具有晶核催化功能，在还原剂存在下能够催化金属离子还原并沉积在颗粒表面，增强光学或电学检测信号，改善测定的灵敏度[5~7].Ma 等[6]采用纳米金种方法，利用盐酸羟胺还原氯金酸，使纳米金长大，目视即可检测到10pg /mL 的人免疫球蛋白IgG.
磁性纳米颗粒具有良好的生物相容性以及快速简便的磁分离性能，已被广泛应用于免疫检测㊁DNA 纯化和测定及磁控输送抗癌药物等领域.结合磁性纳米颗粒和纳米金的优异性能灵敏检测蛋白质和核酸已见报道[8~10].
核酸适体因其在特异性㊁固定化及再生等方面具有的明显优势，逐渐成为化学生物传感器设计中的重
要部分[11,12].Lu 等[13]利用腺苷核酸适体与2种金标核酸探针杂交拉近颗粒间的距离，使纳米金团聚，再加入目标物诱导适体构象变换，使金标探针解离下来，纳米金恢复红.但该方法过程繁琐㊁灵敏度较低.本文在此基础上提出一种用于检测腺苷的新型荧光分析方法.将其中一条含腺苷适体部分的DNA 链连接到磁珠上，另一条探针则通过混合自组装方法固定到纳米金表面，采用2条核酸链杂交简化了分析步骤.对金标探针采用混合组装模式，既保证了其稳定性，又降低了纳米金表面与适体杂交的核酸探针的密度，有利于改善灵敏度.此外，荧光分析技术的应用进一步提高了测定的灵敏度.1 实验部分
1.1 试剂与仪器
寡核苷酸序列购自大连宝生物工程有限公司:(1)腺苷的DNA 核酸适体(Biotin⁃aptamer)序列:5′⁃biotin⁃AAAAAAAGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT;(2)与核酸适体杂交的DNA 序列(P1):5′⁃HS⁃CCCAGGTTCTCT⁃3′;(3)混合修饰纳米金的DNA 序列(P2):5′⁃HS⁃CATCTATCGTCA⁃3′.
腺苷(A)㊁胞啶(C)㊁尿苷(U)和鸟苷(G)(上海捷瑞生物科技有限公司);N ⁃(3⁃二甲氨基丙基)⁃N ′⁃乙基碳二亚胺(EDC，美国Sigma 公司);N ⁃羟基丁二酰亚胺(NHS，美国Acros organics 公司)；链霉亲和素(SA，美国NEB 公司)；牛血清白蛋白(BSA)㊁氯金酸㊁柠檬酸钠㊁抗坏血酸(AA)㊁硫酸铜㊁2⁃(N ⁃吗啉代)乙磺酸(MES)和钙黄绿素(上海国药集团化学试剂有限公司)；羧基化磁性纳米颗粒(MNP，平均粒
径为148nm，上海奥润微纳公司)；其它化学试剂均为分析纯，实验用水为超纯水.10mmol /L 磷酸缓冲溶液(PBS，由10mmol /L Na 2HPO 4和10mmol /L KH 2PO 4配制,pH =7.4)和0.1mol /L PBS(由0.1mol /L Na 2HPO 4和0.1mol /L KH 2PO 4配制,pH =7.0);2⁃(N ⁃吗啉代)乙磺酸缓冲溶液[MES，含10mmol /L 的2⁃(N ⁃吗啉代)乙磺酸,pH =5.0]；含0.1%(体积分数)Tween 20的MES 缓冲溶液(MEST)；硼酸缓冲溶液(BS，含5mmol /L 的硼酸,pH =9.0)；含0.1%Tween 20的硼酸缓冲溶液(BST).Hitach F⁃4500荧光分光光度计(日本日立公司);DKB⁃501A 超级恒温水槽(上海景洪试剂有限公司);CJJ 78⁃1磁力加热搅拌器(金坛市大地自动化仪器厂);pHS⁃3C 精密pH 计(上海雷磁仪器厂);Sigma 3K30高速冷冻离心机(德国Sigma 公司);2HWY⁃100C 恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造
有限公司);JHS⁃1/90机械恒速搅拌器(杭州仪表电机厂).
1.2 MNP 偶联SA 并与Biotin⁃aptamer 结合1.
2.1 羧基化MNP 活化 取一定体积的MNP，洗涤后置于新鲜配制的EDC⁃NHS 溶液中，于37℃活
化0.5h.磁场分离除去未反应的活化剂，依次用MEST 和BST 洗涤，分散至BS 缓冲溶液中.1.2.2 偶联SA 在上述活化的MNP 中加入75μL 1mg /mL SA，调整反应体积为250μL，于37℃偶联反应3h.然后加入10g /L BSA 封闭MNP 上未偶联的活化羧基.反复洗涤，将偶联好的MNP 分散于含有0.2g /L NaN 3和含1g /L BSA 的BST 缓冲溶液中，于4℃下保存.1.2.3 Biotin⁃aptamer 结合 取一定体积偶
联SA 的MNP，加入50μL 1.0μmol /L 的Biotin⁃aptamer，于
37℃振荡反应1h，然后用10mmol /L PBS 洗涤，分散于100μL 含10g /L BSA 的10mmol /L PBS 中,
得到腺苷核酸适体修饰的MNP，记作MNP⁃aptamer，于4℃下保存备用.1.3 纳米金标记核酸探针纳米金参照文献[14]方法制得，经透射电镜测得其平均尺寸约为13nm.
纳米金标记核酸探针(GNP⁃Probe)的制备参照文献[15]方法并略作修改.将一定比例巯基修饰的核酸链P1和P2加入到1mL 纳米金溶液中，静置16h 后加盐老化，在15000r /min 转速下离心分离，将沉积物重新悬于1mL 含0.3mol /L NaCl 和10g /L BSA 的10mmol /L PBS(pH =7.4)中，于4℃下
保存.1.4 荧光滴定法优化铜离子用量
采用荧光滴定法，向1mL 10μmol /L 钙黄绿素的10mmol /L PBS 中逐渐滴加不同量的铜离子，固定激发波长为480nm，入射狭缝和出射狭缝均为5nm，于室温下在500~600nm 范围内扫描荧光发射
光谱，观察荧光光谱的变化.1.5 GNP⁃probe 抑制铜离子对钙黄绿素的荧光猝灭
我行我向80μL 10mmol /L PBS 中依次加入10μL 不同稀释比的GNP⁃probe 溶液㊁5μL 1.0mol /L AA 和5μL 0.1mol /L Cu 2+，室温下放置30min，取反应液3μL 加入到1mL 10μmol /L 钙黄绿素溶液中，固
定激发波长为480nm，入射狭缝和出射狭缝均为5nm，在500~600nm 范围内扫描荧光发射光谱.1.6 腺苷的检测图1为检测腺苷的流程图.分别取一定体积稀释后的MNP⁃aptamer 和GNP⁃Probe 溶液，混合均匀
后调节离子强度，使溶液中含有200mmol /L Na +和5mmol /L Mg 2+，于37℃杂交反应1h，洗涤以除去过量的金标探针，磁场分离.将沉积物分散于30μL 不同浓度的待测腺苷溶液中，于37℃反应1h，磁场分离后将上清液转移至0.5mL 离心管中，依次加入60μL 10mmol /L PBS,5μL 1.0mol /L AA 和5μL 0.1mol /L Cu 2+，室温反应30min.取反应液3μL 加入到1mL 10μmol /L 钙黄绿素溶液中，固定激发波长为480nm，入射狭缝和出射狭缝均为5nm，在500~600nm 范围内扫描荧光发射光谱.3961 No.8 刘雪平等：基于目标物诱导置换及纳米金催化的新型荧光技术检测腺苷
Fig.1 Schematic outline of fluorescence quenching inhibition for adenosine detection based on
strand displacement induced by target⁃aptamer complex and copper deposition catalyzed
by gold nanoparticles
2 结果和讨论
2.1 GNP⁃Probe 抑制铜离子对钙黄绿素荧光猝灭的原理
kpa
钙黄绿素是一种便宜易得的二亚氨基二乙酸荧光素衍生物，其水溶性好，当激发波长为480nm Fig.2 Fluorescent spectra of calcein solution after addition of Cu 2+(a ),AA /Cu 2+(b ),GNP⁃probe /AA /Cu 2+(c ),only calcein (d )and GNP⁃probe (e )c (Calcein)=10μmol /L;c (AA)=50mmol /L;c (Cu 2+)=5mmol /L;the dilution ratio of GNP⁃probe was 1∶500(volume ratio).
时，在500~600nm 范围内能发射较强的荧光
信号(图2谱线d )；与铜离子络合后，发生荧
光猝灭[16](图2谱线a ).如果将抗坏血酸和铜离子预先混合，再加入钙黄绿素溶液中，荧光
信号略有恢复(图2谱线b )，说明在此条件下
抗坏血酸能还原少量铜离子.但是当GNP⁃probe㊁抗坏血酸和铜离子三者混合反应，再取少量加至钙黄绿素溶液中，此时体系的荧光信
我国名画家张善子擅长画什么
号恢复较为明显(图2谱线c ).这是因为纳米金能够催化抗坏血酸将大量的铜离子还原成金属铜原子并沉积在金纳米颗粒表面，导致铜离
子浓度降低，钙黄绿素荧光得以恢复.一定浓
度的纳米金对钙黄绿素本身的荧光信号基本无影响(图2谱线d 和e ).纳米金催化沉积铜也可通过目视观察到，溶液呈现出较为明显的淡红.由图3(A)可见，随着纳米金标记物浓度的增加，体系的荧光信号逐渐增强，表明纳米金在催化沉积铜过程中起关键作用.在一定条件下，荧光强度的变化值与纳米金的量呈线性关系[图3(B)].该方法可应用于基于检测纳米金标记物的生物分析体系.2.2 铜离子用量的优化
钙黄绿素水溶液能发射出较强的荧光信号，但与铜离子络合后发生荧光猝灭，猝灭效率达90%.由图4可见，当钙黄绿素的浓度固定为10μmol /L 时，随着铜离子浓度的增加，荧光强度迅速降低，当铜离子浓度增加到10μmol /L 时，荧光信号变化的速率减慢，当铜离子浓度超过15μmol /L 后荧光信号基本保持不变.考虑到实验中铜离子浓度太低会导致荧光猝灭程度降低，此时纳米金抑制荧光猝灭的动力学范围较窄，而含量过高则导致低浓度的纳米金催化沉铜后体系中仍剩余较多的铜离子，不易使荧光恢复，影响检测的灵敏度.为了使钙黄绿素荧光产生较大程度猝灭，同时又确保体系中残余的量极少，故选用15μmol /L 的铜离子进行实验.4961高等学校化学学报 Vol.33
Fig.3 Enhancing effect of different dilution ratios of GNP⁃probe on the fluorescent spectra of calcein /AA /Cu 2+
抽屉式配电柜system (A )and plot of fluorescent intensity vs .dilution ratio of GNP⁃probe (B )
Dilution ratio of GNP⁃probe from a to j :blank,1∶106;1∶105;1∶104.3;1∶104;1∶103.3;1∶103;1∶102.3;1∶10
2;1∶101.Inset of (B):linear relation between fluorescent intensity and dilution ratio of GNP⁃probe.Error bars represent standard deviations(n =3).
Fig.4 Fluorescent spectra of calcein with varying [Cu 2+](A )and plot of fluorescent intensity vs.[Cu 2+](B )
[Cu 2+]/(μmol㊃L -1)from a to k :0,0.5,2.0,3.8,5.6,7.4,10.0,12.0,15.0,18.0,20.0.
2.3
腺苷的检测原理Fig.5 Effects of free adenosine on the fluorescent spec⁃tra of calcein /AA /Cu 2+system (a )and varying concentrations of adenosine on the fluorescent spectra of calcein /AA /Cu 2+/GNP⁃probe system (b g )Concentrations of adenosine /(nmol㊃L -1)from b to g :0,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,respectively.Inset:calibration curve of fluorescent
intensity vs .logarithm of adenosine concentration.由于纳米金恢复钙黄绿素⁃铜离子体系荧光的灵敏度非常高，我们将其应用于基于检测纳米金标记物的分析体系.以腺苷为模型分析物，实验原理如图1所示.首先,MNP 上修饰的腺苷核酸适体在合适的离子强度下与金纳米颗粒上修饰的核酸探针
P1杂交，经磁场分离后上清液的紫外⁃可见吸收光
谱的峰值明显降低，说明金标探针已经连接到MNP 上.加入目标物腺苷后，与核酸适体发生特异性反
应，形成G 四联体构型[17],1分子适体可与2分子腺苷结合.由于核酸适体构象发生变化，原来杂交湖南新型冠状病毒
的双链上仅剩下5对互补碱基不足以稳定双链结
构，金标探针从MNP 上解离下来，经磁场分离后将
含纳米金标记物的上清液进一步用于催化沉积铜,
使铜离子浓度急剧降低，致使钙黄绿素荧光得以恢
复.为了研究体系中未与MNP⁃aptamer 结合的游离
腺苷对体系荧光信号的影响，我们设计了对照实
验.即在MNP⁃aptamer 中不加金标探针，而是直接
上海电视台体育频道加入10nmol /L 的腺苷，其余操作步骤相同.结果
表明，荧光强度基本无变化(图5谱线a 和b )，说
明腺苷本身几乎不影响体系的荧光信号，进一步证
明荧光增强是由纳米金标记物催化沉积铜引起的.5961 No.8 刘雪平等：基于目标物诱导置换及纳米金催化的新型荧光技术检测腺苷
实验中采用混合探针修饰纳米金，这是因为如果纳米金上探针P1密度过大，每个金纳米颗粒上的P1会与周围多个MNP 上的腺苷核酸适体进行杂交，致使解离出单个纳米金颗粒就需要多个腺苷分子，影
响检测的灵敏度.混合组装可减小金纳米颗粒上探针P1的密度，有利于改善灵敏度.
2.4 腺苷的定量检测在MNP⁃aptamer 和金标探针杂交体系中加入目标物腺苷后，适体构象发生变化，置换出相应的金标探针.游离的金标探针在抗坏血酸存在下能够有效抑制铜离子对钙黄绿素的荧光猝灭.因此通过测定体系荧光强度的变化即可确定目标物的含量.实验结果如图5所示，在一定条件下，荧光强度与腺苷浓度(100pmol /L ~10nmol /L)的对数呈线性相关，线性方程为F =3376.0+1142lg c (c ,nmol /L)，相Fig.6 Selectivity of the proposed method for adenosine assay a .Blank;b .urine;c .cytidin;d .guanosine;e .adenosine /uridine /cytidine /guanosine;f .adenosine.Concentration of other three analogues was 50nmol /L,and 10nmol /L for adenosine.关系数为0.9907，检出限低至80pmol /L，低于文
献[18,19]结果.本实验采用纳米金催化沉积铜信
号转换和放大效应以及荧光检测技术显著提高了腺
苷测定的灵敏度.
2.5 干扰实验考察了腺苷的3种同系物鸟苷(G)㊁尿苷(U)
和胞啶(C)对该分析体系性能的影响.分别用50nmol /L 的G,C 和U 代替腺苷进行实验，由于这些物质不与腺苷的核酸适体发生特异性结合，难以置
换出游离金标探针，因此得到的荧光强度较低，与
空白信号相近(图6谱线b ~d 与a 相比较).此外,
在腺苷中同时加入这3种同系物时，产生的荧光信
号与腺苷单独存在时的基本一致(图6谱线e 和f ),
说明该方法用于检测腺苷具有较好的选择性.3 结 论
建立了一种基于目标物诱导置换及纳米金催化沉积铜抑制钙黄绿素荧光猝灭，用以检测腺苷的新型荧光分析方法.该方法利用磁性纳米颗粒简单快速的分离特性㊁金纳米颗粒优异的晶核催化放大和信号转换功能以及铜离子对钙黄绿素荧光的高效猝灭性能，使分析测定的灵敏度显著提高.此外，核酸适体能够高度特异识别目标物，保证了该方法具有较好的选择性.整个实验过程都在均相中进行，适合大批量分析.
参 考 文 献
[1] Liao K.T.,Cheng J.T.,Li C.L.,Liu R.T.,Huang H.J..Biosens.Bioelectro.[J],2009,24:1899 1904
[2] LIANG Ai⁃Hui(梁爱惠),ZHANG Jing(张静),WEN Gui⁃Qing(温桂清),LIU Qing⁃Ye(刘庆业),LI Ting⁃Sheng(李廷盛),JIANG Zhi⁃Liang(蒋治良).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2010,31(12):2366 2371
[3] MO Zhi⁃Hong(莫志宏),GAO Ying⁃Mei(高应梅),WEN Zhi⁃Yu(温志渝),FAN Yan⁃Ping(范艳萍).Chem.J.Chinese Universities
(高等学校化学学报)[J],2010,31(11):2181 2183[4] Lee J.S.,Han M.S.,Mirkin C.A..Angew.Chem.Int.Ed.[J],2007,46:4093 4096[5] Alfredo E.,Marisa M.C.,Arben M..Biosens.Bioelectron.[J],2009,24:2475 2482[6] Ma Z.F.,Sui S.F..Angew.Chem.Int.Ed.[J],2002,114:2280 2283[7] Murielle R.D.,Benoit L.,Pierre B..Analyst[J],2006,131:923 929[8] Castaneda M.T.,Merkoci A.,Pumera M..Biosens.Bioelectron.[J],2007,22:1961 1967
[9] Mani V.,Chikkaveeraiah B.V.,Patel V.,Gutkind J.S.,Rusling J.F..ACS Nano.[J],2009,3(3):585 594[10] Zhou X.M.,Xing D.,Zhu D.B.,Jia L..Anal.Chem.[J],2009,81:255 261[11] Chen J.W.,Jiang J.H.,Gao X..Chem.A Eur.J.[J],2008,14:8374 8382[12] Wu Z.S.,Guo M.M.,Zhang S.B.,Chen C.R.,Jiang J.H.,Shen G.L.,Yu R.Q..Anal.Chem.[J],2007,79:2933 2939[13] Liu J.W.,Lu Y..Liu J.W.,Lu Y..Angew.Chem.Int.Ed.[J],2006,45:90 946961高等学校化学学报 Vol.33
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议