白云鹏，周㊀洋，申海燕，郝育杰
(北京北方生物技术研究所有限公司研发中心，北京１０００７６
)D O I :１０．１１７４８/b j m y ．i s s n ．１００６－１７０３．２０２１．０４．０３２收稿日期:２０２１Ｇ０１Ｇ１３；修回日期:２０２１Ｇ０３Ｇ１１
摘要：目的㊀以胰岛素(i n s u l i n ,I N S )磁微粒试剂盒(化学发光法)为例，探讨解决磁微粒化学发光主要试剂稳定性问题的方法.方法㊀通过改良连接方法㊁稀释液中添加保护物质㊁试剂的酸碱性等方面对磁微粒试剂(m a g n e t i c r e a g e n t ,M R )进行调整；通过优化标记方法㊁稀释液添加保护物质㊁更换缓冲体系对发光试剂(A E Ｇc o n j u g a t e s r e a g e n t ,R C )进行调整，以２~８ħ标准品的发光值(r e l a t i v e l i g h t u n i t ,R L U )为对照，测定各调整试剂放置３７ħ７d 后标准品发光值的下降率(r a t e o
f d e c l i n e ,R O D )
均值来观察稳定性的改善，对最终选定的方案进行统计学分析.结果㊀调整连接方法使得磁微粒试剂测定３７ħ７d 标准品发光值的R O D 均值为１９．６１％，添加１％鱼皮明胶为１３．５２％，调整缓冲液p H 值至６．５为４．３８％，该方案３７ħ７d 和２~８ħM R 试剂测定２０份样本结果差异无统计学意义(P ＞０．０５)；发光试剂中添加０．１％E D T A 二钾盐R O D 均值为１１．１６％，更换磷酸氢二钠Ｇ磷酸二氢钾缓冲体系为１０．１５％，改良标记方法为７．３５％，该方案３７ħ７d 和２~８ħR C
试剂测定２０份样本结果差异无统计学意义(P ＞０．０５).结论㊀通过调整连接方法，更换缓冲体系以及调整p H 值等可以起到提高这些试剂稳定性的作用.关键词：保护物质;㊀标记方法;㊀缓冲液
中图分类号:R ３９２Ｇ３３㊀㊀文献标识码:A
AP r e l i m i n a r y S t u d y o n t h e S t a b i l i t y o
f t h eM Ra n dR C i n I n s u l i nR e a g
e n tK i t s B A IY u n p e n g ,Z H O U Y a n g ,S H E N H a i y a n ,H A O Y u j
i e (B e i j i n g N o r t hI n s t i t u t eo fB i o l o g i c a lT e c h n o l o g y ,B e i j i n g １
０００７６,C h i n a )A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o i d e n t i f y t h em e t h o d f o r s o l v i n g t h e s t a b i l i t y o f t h eMRa n dR Ci n I n s u l i nK i t s (C L I A )．M e t h o d s MR c a n b e a d j u s t e d b y i m p r o v i n g t h e c o n n e c t i o n m e t h o d ,a d d i n g p
r o t e c t i v e s u b s t a n c e a n d c h o o s i n g t h e s u i t a b l e r e g u l a t i n gp Hv a l u e ,a n dR Cc a nb e u s e d t oo p t i m i z e t h e l a b e l i n g m e t h o d ,t o a d d p r o t e c t i v es u b s t a n c et ot h e d i l u e n ta n dc h a n g et h e b u f f e rs y
s t e m．R L U o ft h e c a l i b r a t o r s s t o r e d a t ２Ｇ８ħw a s u s e d a s r e f e r e n c e a n dR O D s o f t h e c a l i b r a t o r s s t o r e d a t ３７ħf o r ７d a y s w a sm e a s u r e d t o o b s e r v e t h e i m p r o v e m e n t o f s t a b i l i t y ．T h e f i n a l p r o g
r a m w a s s e l e c t e d f o r a s t a t i s t i c a l a n a l y s i s ．R e s u l t s I m p r o v i n g t h ec o n n e c t i o n m e t h o da c h i e v e dt h e MR d e c r e a s et o １９．６１％,w h i l et h e s t a b i l i t y o f １％t e l e o s t e a n g e l a t i n ew a s １３．５２％,a n d t h ed e c r e a s ew a s ４．３８％b y a d j u s t i n g t h eb u f f e r s o l u t i o n s p H v a l u et o ６．５,U n d e r t h i sc o n d i t i o n ,t h e r e w a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h e r e s u l t s o f ２０s a m p l e s t e s t e dw i t ht h e ３７ħMRa n dt h e ２Ｇ８ħMR (P ＞０．０５)．T h eR C SR O D w a s １１
．１６％w i t h ０．１％E D T A p o t a s s i u ms a l t ,w h i l e t h eN a H ２P O ４ＧK H ２P O ４b u f f e r s y
s t e m w a s １０．１５％,a n d i m p r o v i n g t h e l a b e l l e d m e t h o dr e s u l t e di n ７．３５％．T h e r ew a sn os i g
n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e n t h e r e s u l t so f ２０s a m p l e st e s t e d w i t ht h e ３７ħR C a n dt h e ２Ｇ８ħR C (P ＞０．０５)．C o n c l u s i o n T h e s t a b i l i t y o f t h e r e a g e n t c a nb e i m p r o v e db y a d j u s t i n g t h e j o i n i n g m e t h o d ,c h a n g i n g t h eb u f f e r s y s t e m a n da d j u s t i n g t
h e p Hv a l u e ．K e y w o r d s :P r o t e c t i v e s u b s t a n c e ;㊀L a b e l i n g m
e t h o d ;㊀B u
f f e r s o l u t i o n
㊀㊀磁微粒化学发光技术因其自动化水平高，反应时间短等诸多优点成为现在临床检测领域的主力军，市场潜力巨大.国内I V D企业要在市场上立足，产品质量是最根本的保障，在关系质量的性能指标里稳定性是基础的基础，对于试剂来讲尤其重要.产品的稳定性同时也是一个很难解决的问题：诸如某
些小分子抗原，因其分子量小，基团复杂，采取常规的保护措施很难达到要求；有时一个原料换了厂家也可能会带来稳定性变差的现象.在磁微粒化学发光试剂盒中，磁微粒试剂和发光试剂最主要的组分，是试剂盒研发的核心工艺，也是最不容易稳定的组分.主要是因为二者中的连接物与原来的抗原或抗体发生了某些结构上的改变，同时外来物质如亲和素㊁荧光素㊁磁珠㊁吖啶酯与抗原或抗体形成共价键结构时会受到溶液酸碱性的变化，活化剂的使用量等方面的影响，可能导致原有蛋白或分子上的某些活性基团受到破坏或者被覆盖，让连接物的稳定性变差，突出表现就是热稳定性变差.本文以正在研发的胰岛素磁微粒试剂盒中磁微粒试剂和发光试剂的调整为例，进行M R和R C试剂稳定性的调整.分别从连接过程的细节和改变试剂存储环境等方面入手，一一列举了解决方案和思路，最终解决了问题，也总结出一些方法，希望达到帮助同行节省研发时间，少走弯路的目的.
材料和方法
㊀㊀１㊀材料
落井
㊀㊀１．１㊀主要试剂㊀磁微粒(J S R L i f eS c i e n c e s公司,M S１６０/C a r b o x y l,１０％质量浓度)；吖啶酯(苏州亚科公司)；标记抗体(北方所自产单克隆抗体，株号:２G１２)；包被抗体(北方所自产单克隆抗体，株号:１G２);１Ｇ乙基Ｇ(３Ｇ二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐E D C(S i g m a公司);NＧ羟基丁二酰亚胺N H S (S i g m a公司)；牛血白蛋白B S A(S i g m a公司)；甘氨酸(天津福晨)；
鱼皮明胶(S i g m a)；山梨醇(国药集团化学试剂有限公司)；胰蛋白胨(O X O I D)；酪蛋白(S i g m a)；磁微粒偶联缓冲液:０．１m o l/L p H５．２M E Sb u f f e r；磁微粒暂存液:０．１m o l/L p H７．０M E S b u f f e r含１％牛血清白蛋白(B S A).
㊀㊀１．２㊀主要的仪器㊀离心机(S i g m a公司)；生化培养箱(上海一恒科技有限公司)；磁力架(M E R C K 公司)；半自动发光仪(伯托公司).㊀㊀２㊀研究方法
㊀㊀２．１㊀针对磁微粒试剂不稳定的问题的研究方法①优化连接方法：在１支２m L塑料管中，分别加入０．１m L１０％质量浓度磁微粒,０．９m L偶联缓冲液，震荡混匀，磁力架沉降后弃上清，洗涤３次，重悬加０．８m L 磁微粒偶联缓冲液；分别加入０．０２４m L０．２m o l/L E D C，加０．１８m L０．２m o l/LN H S，室温反应３０m i n；洗２次最后一次加入０．８５m L磁微粒偶联缓冲液，加入０．３m g I N S单抗，用０．１m o l/L碳酸氢钠调溶液至p H９，室温震荡反应３h(该步骤后添加改良方法：磁微粒偶联缓冲液洗涤２次，加１０％甘氨酸或乙醇胺０．１m L终止反应１h，加１０％B S A０．１m L封闭磁微粒，反应１h)，加磁微粒暂存液１m L，洗涤２次，重悬至１m L,２~８ħ储存.②添加保护成分：在０．０２m o l/L p H６．５M E SＧT R I S含２０％小牛血清的基质稀释液(１＃试剂)中分别添加质量浓度为１％的山梨醇(２＃试剂),１％鱼皮明胶(３＃试剂),０．５％胰蛋白胨(４＃试剂),０．５％胰蛋白胨(５＃试剂)与基质稀释液对比.③调节试剂的酸碱性.配制p H４．５(６＃试剂)㊁p H５．５(７＃试剂)㊁p H６．５(８＃试剂)㊁p H７．５(９＃试剂)的０．０２m o l/L M
E SＧT R I S含质量浓度为１％鱼皮明胶和含２０％小牛血清稀释液.
㊀㊀２．２㊀针对发光试剂不稳定的研究方法㊀①添加保护成分：在０．０２m o l/L p H６．５M E SＧT R I S含２０％小牛血清的基质稀释液(１０＃试剂)中分别添加质量浓度为０．１％的E D T AＧ２K(１１＃试剂),０．５％蛋白保护剂(１２＃试剂),０．５％P E G６０００(１３＃试剂)与基质稀释液对比.②挑选稀释液：发光试剂分别选择０．０２m o l/L p H６．５M E SＧT R I S含质量浓度为０．１％E D T AＧ２K 和２０％小牛血清稀释液(１４＃试剂);０．０２m o l/L p H６．５T R I SＧH C L含质量浓度为０．１％E D T AＧ２K和２０％小牛血清稀释液(１５＃试剂);０．０２m o l/L p H６．５P B S含质量浓度为０．１％E D T AＧ２K和２０％小牛血清稀释液(１６＃试剂)㊁０．０２m o l/L p H６．５磷酸二氢钠Ｇ磷酸二氢钾含质量浓度为０．１％E D T AＧ２K和２０％小牛血清稀释液(１７＃试剂).③优化标记方法:I N S单抗０．５m g/０．０９５m L(添加改良方法：将单抗３０００r/m i n离心１５m i n，去除杂质)加０．１０５m L０．０５m o l/L碳酸氢钠；吖啶酯(A E)用D M S O溶解成１m g/m L，加入０．０４m L至抗体溶液中，室温反应３０m i n(此步骤后加改良方法：加１０％甘氨酸０．１m L室温反应３０m i n)，反应液装入透析袋，用５L０．０２m o l/L p H值７．４P B透析２d，收集
浓缩物，加０．１m L １０％B S A ，混匀后－１５ħ以下保存.㊀㊀２．３㊀加样和反应模式㊀在反应杯中分别加入
５０μL 标准品(浓度值分别为０μI U /m L ㊁３μI U /m L ㊁１０μI U /m L ㊁３０μI U /m L ㊁７５μI U /m L ㊁１５０μI U /m L ㊁３００μI U /m L )㊁５０μL 发光试剂和２０μL 磁微粒试剂震荡混匀,３７ħ反应２０m i n ，洗涤３次，加激发液和预激发液各１００μ
L ，测定发光值.㊀㊀２．４㊀观察指标㊀I V D 行业一般认为试剂盒在３７ħ放置７d 相当于２~８ħ贮存１２个月效期,
本研发试剂盒的预期有效期为１２个月，所以试剂盒组分都需要考核３７ħ放置７d 的性能指标，本文重点考察标准品发光值变化，实验将放置３７ħ７d 后各研究方法配制的试剂与２~８ħ试剂同时对比检测，计算配对浓度点的发光值下降率R O D (％)＝A B S
(R L U ３７ħ７d /R L U ２~８ħ－１)ˑ１００％,R O D 均值为标准品各浓度R O D 的平均值.R O D 均值小于１０％是业内公认的通过标准品发光值变化考核受试试剂可
以经受３７ħ７d 加速实验较高的合格标准.㊀㊀３㊀统计学处理
㊀㊀两组试剂最终优选出R O D 均值小于１０％的方案.用３７ħ７d 和２~８ħ试剂同时测定２０份样本，采用S P S S １７．０软件，对结果进行配对样本t 检验，计算出P 值，若P ＞０．０５，则两组数据之间差异无统计学意义，试剂热稳定性好.
Snaglt
结㊀㊀果
㊀㊀１㊀连接方法对磁微粒试剂稳定性影响的结果㊀㊀改良连接方法对M R 试剂稳定性改善起到了一
定效果，结果见表１.
表１㊀磁微粒不同连接方法稳定性结果比较
浓度(μ
I U /m L )旧磁微粒连接方法
改良磁微粒连接方法
R L U ２~８ħR L U ３７ħ７d R O D (％)R L U ２~８ħ
R L U ３７ħ７d
R O D (％)０１４９１１５９０６．６４９８９７８３２０．８３３２４０６２１７５９．６０１６３９１３５７１７．２１１０５５３７３４８５３７．０６５４２２４８９４９．７４３０２４７１２１４７４３４０．３４２２８９３１９５８０１４．４７７５１２３４５７６７６０９４５．２４
１２９９１３８４１０３３５．２６１５０４７８８４１３１１９７３３４．８５５４７１７４３８８８１３２８．９４３００９７４０７０
５９３４９３
３９．０７１０３０２７２
９１８４１９
１０．８６R O D 均值(％)
－
－
３０．４０
－
－
１９．６１
㊀㊀对连接方法进行改进使磁微粒试剂的稳定性有所提高,３７ħ放置７d 标准品发光值下降率R O D 均值为１９．６１％.
㊀㊀２㊀添加保护成分对磁微粒试剂稳定性影响的
结果
㊀㊀在基质稀释液(１＃
试剂)
分别添加１％的山梨醇(２＃试剂)
,１％鱼皮明胶(３＃试剂),０．５％胰蛋白胨(４＃试剂),０．５％胰蛋白胨(５＃
试剂)对磁微粒试剂保护效果各有优劣，结果见于表２，图１.
表２㊀磁微粒添加保护成分稳定性比较结果
l-薄荷醇浓度(μ
I U /m L )１＃试剂２＃试剂３＃试剂R L U ２~８ħ
R L U ３７ħ７d
R O D (％)R L U ２~８ħ
R L U ３７ħ７d
R O D (％)R L U ２~８ħ
R L U ３７ħ７d
R O D (％)０５６０６７５２０．５７２５８１６１２．６４９４４８４２．０２３３００８４２２３６６２５．７４０３４６２９６１６２６．６２８４５１２３４５５１７．５６１０１３０１８４１００２３２２３．０１６３５４４１０８４７８３３．７１１６２６７９０３２７２２．３１３０４４８０３６３５６５２３２０．４４５５５９６３３５６３９２６．３３１８５９７２８３７２７１０．９４７５９０８９３７８０６２４３１１．３９６８９５３７２８６３１２４．８７３４８０４６４４８１０１２．２５１５０１５４８２７０１２８４７４５１７．０１５１９８２５１２０５１２３２０．７１１５８２３１９５２４８５１７．７６３００２２７５７０５
１７３１３２３
２３．９１９８２６３７
１５１５９８０
２３．５１６３７０２２
１４４４０９４
１１．７９R O D 均值(％)
－
－
２０．３
－
－
宣毒发表汤２４．０
－
－
１３．５２
(续表２
)浓度(μ
I U /m L )４＃试剂５＃试剂R L U ２~８ħ
R L U ３７ħ７d
R O D (％)R L U ２~８ħ
R L U ３７ħ７d
R O D (％)０５３５７５０４０．２５４４７５０３７．９３３６７３５２９０９１２０．８３６１８４２５１５６３０．５１０１４２１９４１０９６２９２２．９１５０４５６９５６６４３６．４３０４５２１６５３４０９５７２４．６４８２１５８３３１００２３１．３７５１０２２６８４８２９３０６１８．９１０２８４７８６８０２４４３３．９１５０１６４５９１０１０８１０１２３４．３１６１６６０２１１９３５４４２６．２３００１８７９９４３
１５３２７９４
１８．５２０９３３３６
１６３６０１５
２１．８R O D 均值(％)
－
－
２５．７
－
－
３１．
１
图１㊀缓冲液中添加不同保护成分后发光值下降率图
㊀㊀从结果来看,
缓冲液中添加１％鱼皮明胶在所有添加物中效果最明显，使得磁微粒试剂的稳定性进一步提高,R O D 均值为１３．５２％.
㊀㊀３㊀调节稀释液p H 值对磁微粒试剂稳定性影响
的结果
㊀㊀p H ４．５(６＃试剂)㊁p H ５．５(７＃试剂)㊁p H ６．５(８＃试剂)
㊁p
H ７．５(９＃
试剂)
稀释液对M R 稳定性起到关键的影响，结果见表３.
表３㊀磁微粒试剂不同p H 值对稳定性影响的结果
浓度(μ
I U /m L )６＃试剂７＃试剂R L U ２~８ħR L U ３７ħ７d R O D (％)R L U ２~８ħR L U ３７ħ７d R O D (％)０２４３０１５０８３７．９４３３８６１９１１４３．５６３１３０９４８９７４２６２５．６０２０４９８２１４４３６９２９．５７１０６８７３３４３７５４１１４５．３８７４４３８３４７５３５５３６．１４３０２５９４１８４１１３８２４９５６．１２２３９９７６３１５９９２７０３３．３６７５５６２２９５５２８８３４７３４８．７２５５５７００７４４３９９４０２０．１０１５０１０７９０６４４５４５６６９６４９．４３８３７４４６０８５８６０４５２．５３３００１５０６６３４６
７１７３３７４
５２．３９１３２９９３９７
１１５１７２３６
１３．４０R O D 均值(％)
－
－４５．０８
－
－２５．５２
浓度(μ
I U /m L )８＃试剂９＃试剂R L U ２~８ħR L U ３７ħ７d R O D (％)R L U ２~８ħR L U ３７ħ７d R O D (％)０３２８７３２２０２．０４３１２２１６１５４８．２７３１９９３０２２０４１５８２．４４２２４３００９０７２８５９．５５１０７４９４５３８３５５３０１１．４９６７８９１
４１４８１０５７８．１９３０２１５０３２３２２４４２３０４．３７２２０４４４８１１０７０７３４９．７８７５５３９３４４６５３５８７８３０．６４６０９２３６８３０３０７１０５０．２５１５０９３９２６０４１０２４９７０２９．１３８９６２０５０５２８６９９５４１．０１３００１３５２３１２１
１３５９７８４２
０．５５１２３５３１５８
８１４８９４７
３４．０３R O D 均值(％)
－－
４．３８
－
－
５１．５８㊀㊀当磁微粒试剂的p H 值为６．５时,
试剂烤置３７ħ７d 标准品发光值R O D 均值为４．３８％，说明此时试剂的稳定性已经满足预期要求，采用该方案配
制的２~８ħ和３７ħ７d 磁珠试剂测定２０份样本的配对样本t 检验，结果见表４.
表４㊀２０份样本的配对样本t 检验结果
与试剂进行配对样本t 检验,P 值为０．０８６,P ＞０．０５，说明３７ħ７d 试剂与２~８ħ试剂测值差异没有统计学意义.
㊀㊀４㊀添加保护成分对发光试剂稳定性影响的
结果舆情
在基质稀释液１０＃试剂)
中分别添加的
E D T A Ｇ２K (１１＃试剂),０．５％蛋白保护剂(１２＃试剂)
,０．５％
P E G ６０００(
１３＃
试剂)
对R C 试剂稳定性有不同影响,
结果见表５.
表５㊀不同保护成分对R C 试剂稳定性的影响结果
浓度(μ
I U /m L )１０＃试剂１１＃试剂R L U ２~８ħR L U ３７ħ７d
R O D (％)R L U ２~８ħR L U ３７ħ７d
R O D (％)０１０７６８２１２３．７０１０５７９２９１２．１１３２１４６３１５３０４２８．７０１９８１２１７９３７９．４６１０４９５４６３９９８３１９．３０４９９４１４５２８７９．３２３０１０７６５２９１９５７１４．５８１０７５３４１０００４９６．９６７５２３７１６２１９９５９９１５．８４２６８３３２２１９７２０１８．１２１５０７０２２８３５９１５３７１５．７７８３５９９８７０８４６９１５．２５３００１６８０９０８
１２５４２７２
２５．３８１８２３６０５
１６９８１５０
６．８８R O D 均值(％)
－
－２０．４７
－
－１１．１６
浓度(μ
I U /m L )１２＃试剂１３＃试剂R L U ２~８ħR L U ３７ħ７d
R O D (％)R L U ２~８ħ
R L U ３７ħ７d沥青混合料车辙试验
R O D (％)０１０６１９０４１４．８０７３１５６７２２．４４３２０５４７１６６４１１９．０１１５６２５１１３１８２７．５６１０５５９４３４２５２０２３．９９３９７０９２９２１６２６．４２３０１０８３３１７３１９１３２．４４８２５３７６０５７１２６．６１７５２４４５７
２２０５９２０１５．８０１７４４１１１４６３２７１６．１０１５０８２８４２３６２０４６０２５．１０６２３８０９４２０６９２３２．５６３００１６８５４３１
１２３４７１９
２６．７４１４１３１４３
８５４７９５
３９．５１R O D 均值(％)
－－
２２．５６
－
－
２７．３２
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