赵景华;吴兆明;丁宇宁;刘文文;颜泽;柯冰冰;沈萍;胡建恩
【摘 要】胶原蛋白是动物体内重要的结构蛋白质,因具有生物可降解性、生物相容性、无毒等 特性而被广泛应用.本文综述了戌二醛、P-环糊精聚轮烷单醛、丙二酸等交联剂对胶原蛋 白进行化学改性的方法研究现状,并介绍了胶原蛋白改性材料在止血、药物运输载体、组织 工程支架等方面应用的研究进展. 【期刊名称】《渔业研究》
【年(卷),期】2017(039)002
【总页数】10页(P147-156)
【关键词】胶原蛋白;化学改性;交联剂
【作 者】赵景华;吴兆明;丁宇宁;刘文文;颜泽;柯冰冰;沈萍;胡建恩
【作者单位】大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连116023
【正文语种】中 文
【中图分类】TS254.9
胶原蛋白(Collagen)主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，约占动物体内蛋白质总量的30%，是结缔组织中极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体等作用[1]。胶原蛋白的分子量约为300 kDa，由三条分子量相近的肽链组成，三条肽链相互缠绕，通过氢键连接形成稳定的三螺旋结构。三条肽链的交联强度高度可变，这与胶原蛋白的类型、组织、物种、年龄等因素密切相关[2-3]；胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸(Gly)、脯氨酸和羟脯氨酸，形成典型的(Gly-X-Y)结构(X、Y代表其他氨基酸)，在每条肽链上都有(Gly-X-Y)重复结构出现，它是形成胶原原纤维的主要结构；其中羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，它可以形成分子内氢键，对于稳定胶原蛋白的三螺旋结构有着重要作用[4]。胶原蛋白因具有这些独特的结构，而具有生物可降解性、生物相容性、无毒性、低抗原性、细胞黏附等特性[5]。但是胶原蛋白机械强度低、生物降解速率难以控制、易变性等缺点限制了其应用，对胶原蛋白进行改性不仅能提高胶原蛋白的机械强度、热变性温度等特性，还可以有效控制胶原蛋白的降解速率，使改性后的胶原蛋白材料被广泛用于止血、
药物运输载体、组织工程支架等方面[6]。本文主要总结了胶原蛋白的化学改性方法及其改性后应用的研究进展。
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与物理改性方法相比，化学改性方法在调整和控制胶原蛋白的结构和性质，提高胶原蛋白的拉伸强度、柔韧性等机械性能，控制胶原蛋白的生物降解速率，提高胶原蛋白的热稳定性等方面效果更显著[7]。胶原蛋白的化学改性以交联改性为主，主要的交联剂包括醛类、二羧酸类、京尼平、碳化二亚胺、柠檬酸衍生物、壳聚糖和聚乙烯醇等。c型人格
农业天地1.1 醛类
戊二醛是最早使用的一种交联剂，它具有水溶性、双官能团、价格低等优点[8]。胶原蛋白中的伯氨基能与戊二醛的两个醛基发生反应形成希夫碱，将胶原蛋白分子以五元环的形式连接起来(图1)[9]。曹建等[10]研究了戊二醛改性胶原蛋白的最佳条件：pH8、戊二醛浓度2%、反应时间1.5 h、温度60℃，在此条件下，胶原蛋白的乳化性和乳化稳定性都最好。但是将不同戊二醛浓度(0.1%～1.0%)改性的胶原蛋白植入到大鼠皮下，会对大鼠皮肤产生不同程度的侵蚀，大鼠皮肤会出现炎症反应和细胞毒性，并且周围组织会出现一定程度的钙化[11]。因此，戊二醛常用其他醛类物质替代。
Sa Liu等[12]成功合成了一种新型醛类交联剂，即β-环糊精聚轮烷单醛，它能与胶原蛋白进行交联且无显反应，胶原蛋白的伯氨基与β-环糊精聚轮烷单醛的醛基反应生成希夫碱。经β-环糊精聚轮烷单醛改性后的胶原蛋白热变性温度为81.6℃，交联度高达87.1%，远高于相同浓度的戊二醛改性的胶原蛋白的热变性温度和交联度。在细胞毒性研究实验中发现经β-环糊精聚轮烷单醛改性后的胶原蛋白无细胞毒性。
1.2 二羧酸类
常用的交联剂与胶原蛋白交联主要以共价键作用为主，研究表明在胶原蛋白改性时，仅共价键占主导地位，会限制胶原蛋白材料所需的机械强度和生物相容性等性能，二羧酸可以通过非共价键作用与胶原蛋白交联，使胶原材料的拉伸强度、断裂伸长率等机械性能显著提高，生物相容性显著增强[13]。
丙二酸是一种简单的二羧酸，无毒且价格低廉，主要通过非共价键作用与胶原蛋白交联[14]。Tapas Mitra等[15]研究了丙二酸与胶原蛋白的交联机理，如图2所示，胶原蛋白上赖氨酸的氨基与丙二酸的羧基通过质子交换和离子间相互作用形成了一种新型三维支架材料。胶原蛋白与丙二酸交联的最佳条件为：胶原蛋白为0.5%、丙二酸为0.2%，在此条件下
制备的支架材料的拉伸强度(7.9 MPa)、断裂伸长率(11.8%)、杨氏模量(66.0 MPa)等机械强度达到最大，交联度为78%，变性温度达到128℃，经扫描电子显微镜(SEM)观察其结构高度多孔。噻唑蓝(MTT)试验结果表明该支架材料无细胞毒性且具有良好的生物相容性，适合用于组织工程研究。Tapas Mitra先后还研究了乙二酸[14]、丁二酸[16]、庚二酸[17]与胶原蛋白的交联作用，结果表明经二元羧酸改性后胶原蛋白的拉伸强度、断裂伸长率等机械性能、热稳定性、生物相容性等都得到了显著的改善。
1.3 京尼平
路径依赖京尼平是从栀子果实中提取的化合物，它具有羟基、酯键等多种活性基团，可直接与氨基酸或蛋白质反应[18-19]。胶原蛋白与京尼平的反应机理如图3所示，京尼平先与胶原蛋白的氨基作用，生成具有环烯醚萜的氮化物，经过脱水作用得到芳香族的单体，再经过自由基反应的二聚作用，产生分子内和分子间环状的交联结构[20]。
胶原蛋白是细胞生长的支架材料，具有促进细胞黏附和诱导细胞生长分化的作用，被广泛用于组织工程学研究[21-22]。Xiujie Zhang等[23]以京尼平作为交联剂与Ⅰ型胶原蛋白交联制备支架材料，并研究了两者交联的最佳条件：京尼平浓度为0.3%、交联温度为37℃，在
此条件下制备的支架材料经SEM观察其形态结构与纯胶原蛋白相比发生了改变，由片状结构变为网状结构；同时其溶胀率、抗压强度、降解速率、稳定性与纯胶原蛋白相比都得到了显著的改善；MTT实验结果表明该支架材料具有良好的生物相容性且细胞毒性低。王刚等[24-25]将人脂肪间充质干细胞接种于京尼平改性的胶原蛋白支架材料上，细胞在该支架上生成了成熟脂肪样细胞，表明京尼平对人脂肪间充质干细胞的毒性低，且京尼平交联的胶原蛋白与该细胞具有良好的生物相容性。
1.4 碳化二亚胺
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碳化二亚胺(EDC)属于酰胺型交联剂[26]。EDC与胶原蛋白的反应机理如图4所示，EDC可以促进胶原蛋白的谷氨酸或天冬氨酸的羧基与氨基连接形成酰胺键，EDC本身不成为实际交联的一部分，而是形成可溶于水的脲衍生物，可以通过冲洗除去，避免引入有毒物质[27]。
为提高EDC的交联效率，EDC常与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联用。王迎军等[28]用EDC/NHS作为交联剂，与胶原蛋白交联，研究表明改性后胶原蛋白的热稳定性、形态稳定性增强，抗酶解能力显著提高，经SEM观察其结构更加紧密有序。Gloria等[29]分别用ED
C/NHS、戊二醛、京尼平作为交联剂，制备胶原蛋白支架材料，比较不同交联剂对胶原蛋白结构和性能的影响。将交联后的胶原蛋白放入磷酸盐缓冲液(PBS)中1、2、3个月后发现戊二醛交联的胶原蛋白纤维结构很快消失，京尼平交联的胶原蛋白在2～3个月后纤维结构完全消失，EDC/NHS交联的胶原蛋白在浸泡3个月后仍能保持完整的纤维结构，说明EDC/NHS能提高胶原蛋白的结构稳定性。将人骨髓间充质干细胞植入到胶原蛋白支架上，发现EDC/NHS交联的胶原蛋白支架材料无细胞毒性且具有良好的细胞相容性。
1.5 柠檬酸衍生物
Tetsushi等[30]用N-羟基琥珀酰亚胺修饰柠檬酸的三个羧基制备了一种新型交联剂，即柠檬酸衍生物(CAD)。CAD中有三个活性酯基，可以与胶原蛋白中赖氨酸或羟基赖氨酸的氨基反应形成酰胺键(图5)。细胞毒性研究结果表明，经CAD改性后，胶原蛋白材料的细胞毒性比戊二醛低10倍；将该材料植入到老鼠皮下7 d内被完全降解且无炎症反应。
1.6 壳聚糖
壳聚糖是天然阳离子多糖，无毒，具有生物相容性、生物可降解性、抗菌活性和止血等性
能，可应用于手术缝合线、药物运输载体和伤口敷料等方面[31]。胶原蛋白与壳聚糖之间通过氢键和静电作用在氨基、羟基等基因之间形成交联，使胶原-壳聚糖复合材料形成三维立体结构[32]。
陈达佳等[33]以胶原蛋白和壳聚糖为原料制备了可食用复合膜，研究了胶原蛋白与壳聚糖的质量比、甘油添加量、热处理温度及时间等工艺参数对可食用复合膜性能的影响。结果表明，在胶原蛋白与壳聚糖质量比6∶4、甘油添加量20%、热处理温度70℃、热处理时间30 min的条件下，得到的复合膜表面光滑无气泡，拉伸强度达到22.0 MPa，断裂伸长率达到127.4%。Mingmao Chen等[5]用冷冻干燥法制备了胶原蛋白-壳聚糖止血海绵，研究了胶原蛋白与壳聚糖的最佳比例、止血海绵的性质及结构。结果表明，胶原蛋白与壳聚糖最佳比例为1∶0.25；SEM观察止血海绵呈高度多孔的网状结构；MTT实验和体外溶血实验表明止血海绵无细胞毒性，无溶血现象；止血实验表明该止血海绵与医用纱布、纯胶原蛋白相比，止血时间短且失血量少。
1.7 聚乙烯醇
聚乙烯醇是一种水溶性的高分子聚合物，对人体无毒副作用，具有生物可降解性和生物相
容性，其力学性能优良，化学性质稳定，常被用做软骨移植材料、烧伤敷料、药物运输载体等[34]。聚乙烯醇中含有大量的羟基，可以与胶原蛋白中的氨基通过氢键连接形成更稳定的大分子物质。
李沁华等[35]以胶原蛋白、聚乙烯醇、透明质酸为原料，制备三维多孔的复合材料，考察了三者之间的比例对复合材料性质的影响。研究表明，三者(聚乙烯醇∶胶原蛋白∶透明质酸)质量比为15∶4∶0.24时，复合材料的综合性能最佳，具有较高含水率(58.0%～81.3%)和膨胀率(1.5～4.6倍)；经SEM观察呈互相交错的多孔结构，有利于构建组织工程支架材料。Asran等[36]以聚乙烯醇、胶原蛋白、羟基磷灰石为原料，三者之间通过氢键连接形成一种新型三维支架材料，该支架材料孔隙率为49.5%；具有较强的拉伸强度(1.0 MPa)和弹性模量(11.1 MPa)；透射电镜观察该支架材料与骨具有相似的纳米结构，有望作为骨移植材料应用于组织工程。
2.1 止血材料
胶原蛋白因具有生物相容性、血液可吸收性、低免疫原性等性能而被广泛用作止血材料。胶原蛋白止血材料具有多孔网状结构，与出血创面接触时，利用其毛细作用迅速吸附伤口新闻游戏
处血液，促使血小板凝聚，产生凝血酶，而凝血酶通过再催化过程将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血液凝固，达到止血的目的[37]。
徐志霞等[38]以碳化二亚胺为交联剂，制备的胶原蛋白止血海绵能有效地缩短创面出血时间，减少出血量，其止血效果优于市售明胶海绵。程玮璐等[39]利用氧化再生纤维素(ORC)作为胶原蛋白海绵中的填料，制备的止血海绵与未添加ORC的胶原海绵相比，其力学性能更好，止血时间更短，植入动物体内28 d后被完全降解且对周围组织无影响。Kevin等[40]用聚乙二醇修饰胶原蛋白制成胶原蛋白止血膜，发现该膜在猪肺动脉大量出血时具有很强的组织粘附性和止血特性。Jyh-Ping等[41]通过静电纺丝技术制备了胶原蛋白-壳聚糖-聚环氧乙烷纳米纤维膜，该纤维膜无细胞毒性，且止血效果强于医用纱布和市售明胶海绵。
2.2 药物释放载体材料
胶原蛋白是一种结缔组织蛋白，具有生物相容性、生物可降解性和低免疫原性，可以作为理想的药物载体材料[42]；可以通过控制胶原蛋白的结构来实现对药物的缓慢释放，将胶原蛋白交联成高度多孔的网状结构，使其机械强度提高，载药量增加，生物降解速率减慢， 以此来延长药物的释放时间[43]。
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