doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2022.11.013
·免疫学技术与方法·
基于荧光纳米粒子的新型冠状病毒核衣壳蛋白免疫层析快速检测试剂的研制① 张赛王刚刘仲明②李辉军③钱纯亘④（深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，深圳518116）
中图分类号Q816文献标志码A文章编号1000-484X（2022）11-1355-07
［摘要］目的：建立新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原快速检测试剂的制备方法，并对检测试剂的性能指标进行评价。方法：以羧基荧光纳米粒子标记的羊抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白（NP）多克隆抗体及鸡IgY为标记抗体，硝酸纤维素膜上分别包被鼠抗N蛋白单克隆抗体和羊抗鸡IgY抗体作为检测线和质控线制备免疫荧光试纸条，对试剂最低检出限、交叉反应性、重复性、临床诊断灵敏度和特异性进行性能评价。结果：检测N全长重组蛋白及热灭活培养物的最低检出限分别为13.8pg/ml和1.6×102TCID50/ml；测试16种常见呼吸道病原体高浓度样本均无交叉反应；高、低两个浓度参考品变异系数（CV）分别为7.68%和4.98%。临床鼻咽拭子样本及健康人鼻拭子样本测试，诊断灵敏度为86.36%（19/22），特异度为99.16%（355/358），总符合 率为98.42%（374/380）；一致性检验Kappa值为0.8553（P<0.05）。结论：SARS-CoV-2荧光抗原检
测试剂检测灵敏度和特异性高，检测速度快，操作便携，可作为现有核酸检测法的补充手段，用于新型冠状病毒的早期筛查。
［关键词］荧光纳米粒子；新型冠状病毒；核衣壳蛋白；免疫层析
A fluorescent nanoparticles-based lateral flow immunoassay for rapid detection of SARS-CoV-2nucleocapsid protein
ZHANG Sai，WANG Gang，LIU Zhongming，LI Huijun，QIAN Chungen.Shenzhen YHLO Biotech Co.，Ltd.，Shenzhen518116，China
［Abastract］Objective:To establish a fluorescence immunochromatographic assay for the rapid detection of antigen against severe acute respiratory syndrome coronavirus2（SARS-CoV-2）and to evaluate its clinical performance.M ethods:The polyclonal antibody of sheep anti-SARS-CoV-2nucleocapsid protein（NP）and chicken IgY were labeled with carboxyl fluorescent nanoparticles. The monoclonal antibody of mouse anti-nucleocapsid protein and goat anti-chicken IgY were coated on the nitrocellulose membrane as detection line and quality control line to prepare immunofluorescence test strip.The performance of the limit of detection，cross-reactivity，repeatability，specificity and sensitivity of clinical diagnosis were evaluated.Results:The limit of dete
ction for N recombi‐nant protein and heat inactivated SARS-CoV-2were13.8pg/ml and1.6×102TCID50/ml，respectively.There were no cross reaction with high concentration samples or cultured virus of16common pathogens.The coefficients of variation（CV）of high and low reference materials were7.68%and4.98%.Clinical nasopharyngeal swab samples and nasal swab samples of healthy people were tested，the sensitivity was86.36%（19/22），the specificity was99.16%（355/358），the total coincidence rate was98.42%（374/380），and the Kappa consistency test had a Kappa value of0.8553（P<0.05）.Conclusion:SARS-CoV-2fluorescent antigen detection reagent has high detection sensitivity and specificity，high detection speed，and is portable to operate.It can be used as a supplement to existing nucleic acid detection methods for early screening of novel coronavirus.
［Key words］Fluorescent nanoparticles；SARS-CoV-2；Nucleocapsid protein；Immunochromatographic assay
①本文受深圳市科技创新委员会“新型冠状病毒肺炎疫情应急防治”悬赏项目（2020254008）；深圳市龙岗区科技发展资金“新型冠状病毒感染应急防治”科技专项项目（LGKCXGZX2020012）资助。
②中国人民解放军南部战区总医院，广州510010。
③华中科技大学同济医学院附属同济医院，武汉430030。
④通信作者，华中科技大学生命科学与技术学院，武汉430074，E-mail：chungen_qian@hust.edu。
作者简介：张赛，男，硕士，工程师，主要从事免疫快速检测技术方面的研究，E-mail：zhangsai0623@126。
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是正链单股RNA 病毒，是已知基因组最大的RNA病毒之一，有包膜，属冠状病毒科。该科分为α、β、δ和γ4个属，SARS-2012cctv民族器乐电视大赛
CoV-2为β属，可引起新型冠状病毒性肺炎（COVID-19）［1］。目前SARS-CoV-2检测技术主要有分子诊断的荧光定量PCR技术（RT-PCR）、基因测序技术、基因编辑技术及免疫学检测的免疫层析法、化学发光法和酶联免疫吸附法［2-12］。COVID-19确诊病例诊断的“金标准”是病毒核酸的检出，不过，受样本类型、样本质量和检测技术等方面因素限制，基于核酸的检测存在一定程度的“假阴性”［13］。研究显示感染SARS-CoV-2后，人体会在约7d时产生针对病毒的IgM抗体，约14d会产生病毒的IgG抗体，可见基于免疫学的抗体检测对于病毒的早期筛查并不适用［14］。在实际诊断过程中，抗体检测法也暴露出较多的假阳性问题，不能单独作为诊断指标用于筛查，只能作为当核酸检测为阴性时的辅助诊断方法［15-16］。由于核酸检测和抗体检测在诊断中所暴露出的问题，除CT等临
床症状指标外，临床医生急需一种能够快速诊断COVID-19的方法，以实现对人的大规模筛查。
基于免疫学的抗原快速检测技术采用双抗体夹心法，可有效提高免疫学方法的特异性，减少假阳性的发生；检测一个样本仅需10~20min，可以做到现场快检，操作简便，无需特殊设备和人员培训；同时由于抗原蛋白较稳定，相对于核酸检测技术对样本的要求也相对较低［17-19］。目前国内外已上市的抗原快速检测试剂检测灵敏度差异较大（30.2%~ 93.9%），检测灵敏度偏低与样本病毒载量及试剂盒质量均有关系［9，20］。本研究采用荧光层析双抗体夹心法研制SARS-CoV-2N蛋白抗原快速检测试剂盒，并对试剂盒的性能指标进行了系统地验证，以评估试剂盒在快速诊断COVID-19的价值。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样本来源在希腊ROUMPEA医学实验室对有临床症状的SARS-CoV-2患者及其密切接触者进行双份鼻咽拭子样本采集，一份用于核酸检测，一份用本研究所制备的抗原检测试剂盒的检测，共计89例；另外用同一批试剂卡对本公司采集的291例健康人鼻拭子样本进行检测。
1.1.2试剂与仪器2-（N-吗啉）乙磺酸（MES）、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白钠盐（Casein sodium salt）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、Nonidet P40（NP-40）、Pro‐clin300购自美国Sigma公
司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；海藻糖、Tween20、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾购自国药集团上海化学试剂有限公司；羧基荧光纳米粒子购自美国Ocean NanoTech公司；羊抗N蛋白多克隆抗体、鼠抗N蛋白单克隆抗体、N全长重组蛋白购自菲鹏生物有限公司；鸡IgY 和羊抗鸡IgY抗体购自南京京达生物技术有限公司；SARS-CoV-2灭活培养物购自美国ATCC；其他试剂均为分析纯。
Legend Micro21R高速微量离心机购自美国Thermo Scientific公司；XYZ三维划膜喷金仪、吸水纸及PVC底板购自上海金标生物科技有限公司；HGS201切条机购自杭州峰航科技有限公司；超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q超纯水机购自美国Millipore公司；纳米粒度及Zeta电位分析仪购自英国Malvern公司；UNICELL-S荧光免疫分析仪购自深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司；玻璃纤维素膜购自芬兰Ahlstrom公司；硝酸纤维素购自德国Merck公司。
1.2方法
1.2.1荧光纳米粒子标记偶合物的制备采用EDC/NHS法制备荧光纳米粒子抗体偶合物［21］。取1ml（1%）羧基荧光纳米粒子于2ml低吸附离心管中，12000r/min离心10min，去除上清，加入1ml MES缓冲液（50mmol/L，pH=6.0），超声分散；加入EDC、Sulfo-NHS各5mg，25℃恒温振荡反应20min，
12000r/min离心10min，去除上清，再加入1ml MES 缓冲液（50mmol/L，pH=6.0），超声分散，12000r/min 离心10min，去除上清，重复1次以除去多余的EDC、Sulfo-NHS。
海德堡cp2000取活化后的荧光纳米粒子，加入1ml MES缓冲液（50mmol/L，pH6.5），超声分散；加入0.4mg羊抗N蛋白多克隆抗体或鸡IgY抗体，25℃恒温振荡反应2h，12000r/min离心10min，去除上清；加入1ml 封闭液（50mmol/L Tris，pH=8.0，0.5%BSA），超声分散，12000r/min离心10min，去除上清；加入1ml 保存液（50mmol/L Tris，pH=8.0，0.5%酪蛋白钠盐，0.1%Tween20，10%海藻糖，0.05%Proclin300），超声分散，4℃避光保存。
1.2.2荧光偶合物颗粒平均直径及Zeta电位测试用超纯水将荧光纳米粒子和标记后的荧光纳米粒子抗体偶合物稀释100倍，取1ml加入比皿
中，放入纳米粒度仪测定颗粒的平均直径、分布系数PDI 及Zeta 电位。
1.2.3抗原检测试剂的制备将玻璃纤维素膜用样本垫处理液涂布处理，45℃烘干12h 。用偶合物稀释液稀释荧光纳米粒子标记的羊抗N 蛋白多克隆抗体偶合物和鸡IgY 抗体偶合物，体积占比分别为15%和2%，用XYZ 三维划膜喷金仪按4µl/cm 在偶合物垫上平行喷两条线，45℃干燥24h 。用含有0.01mol/L pH7.4PBS ，5%海藻糖的包被液分别稀释鼠抗N 蛋白单克隆抗体、羊抗鸡IgY 抗体至2.0mg/ml 和1.0mg/ml ，分别作为检测线（T 线）和质控线（C 线）捕获抗体包被在硝酸纤维膜（NC 膜）上，45
℃烘干48h 。将制备好的NC 膜、偶合物垫、样本垫及吸水垫依次粘贴在PVC 底板上，用切条机裁切为4.0mm/条，装入检测卡，铝箔袋封装。
测试时将鼻拭子或鼻咽拭子插入预装有提取液（10mmol/L PBS ，pH=7.4，1%NP -40）的提管中，抽提15s 后滴加3滴（100µl ）至检测卡加样孔，反应15min 后进行荧光免疫分析仪测试。试剂ID 卡内置临界信号值，样本信号与临界信号（阴性样本信号值加3倍标准偏差）的比值作为测试结果，单位“COI ”，结果≥1COI 为阳性，<1COI 为阴性。试纸条结构、原理及测试过程如图1、图2所示。
1.2.4最低检出限用健康人鼻拭子洗脱液作
为阴性基质将N 全长重组蛋白从1000pg/ml 2倍梯度稀释，每个浓度取100µl 加样，重复10次，以N 蛋白浓度为横坐标，荧光信号T/C 值为纵坐标建立标准曲线。参照CLSI E17-A2文件［22］进行最低检出限研究，LOD =LOB +1.653×SD low positive 。其中LOB 为空白限，选择5个空白样本，每个样本测试4次，连续测试3d ，共60个结果；SD low positive 为低浓度样本标准偏
差，选择5个低值样本，每个样本测试4次，连续测试3d ，共60个结果。
用热灭活病毒培养物（ATCC ，货号VR -1986HK TM ，批号70036071，浓度1.6×105TCID 50/ml ）进行最低检出限研究。选用健康人鼻拭子洗脱液作为阴性基质，先10倍梯度稀释，测试出现阴性结
果后从上一浓度再2倍梯度稀释，选择20次测试中≥19次阳性的浓度水平（≥95%）作为试剂的最低检出限。1.2.5
交叉反应分析
本实验室收集的肺炎支原
小夜曲托斯蒂
体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、金黄葡萄球菌、流感嗜血杆菌、冠状病毒OC43、冠状病毒229E 、冠状病毒NL63、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒（2009）、乙型流感Vic‐toria 、乙型流感Yamagata 、呼吸道合胞病毒A 型、呼吸道合胞病毒B 型、腺病毒3型共计16种呼吸道病原体高浓度毒株进行交叉反应测试，每个病原体测试1次。1.2.6
重复性测试
选择62.5pg/ml 和500pg/ml
两个浓度的N 蛋白参考品进行重复性测试，每个浓度重复测试10次，统计变异系数（CV%）。1.2.7
临床性能评价
在希腊ROUMPEA 医学实
验室用圣湘生物iPonatic 快速核酸检测系统及本研究所制备的抗原检测试剂盒同时取鼻咽拭子样本进行临床比对测试；用同一批试剂卡对本公司采集的291例健康人鼻拭子样本进行特异性检测。1.3
统计学分析
使用IBM SPSS20.0软件对数
据进行统计分析，采用Kappa 检验，统计分析所研制的新型冠状病毒抗原检测试剂的临床性能。
2
结果
2.1
荧光偶合物粒径和Zeta 电位分析
采用动态
光散射法（DLS ）表征荧光纳米粒子及荧光纳米粒子偶合物的粒径大小及分布［23］，结果如表1和图3所
示，荧光纳米粒子的平均直径为（610.80±5.66）nm ，分布系数PDI 为0.15±0.02，近单分散体系，
表明荧
图2测试过程
Fig.2
Procedure for
assay
图1试纸条结构及原理图
Fig.1
Schematic diagram of structure and principle of antigen test strip
光纳米粒子粒径均一，尺寸分布较窄。Zeta电位是表征胶体分散系稳定性的重要指标，体系稳定与否通常以Zeta电位是否>±30mV为标准［24］，本研究所采用的荧光纳米粒子Zeta电位为−（42.95±0.78）mV，表明荧光纳米粒子溶液稳定性较好。
从表1和图3中可以看出，羊抗N蛋白多克隆抗体及鸡IgY荧光纳米粒子偶合物与未标记的荧光纳米粒子相比，粒径和分布系数变化不明显，均尺寸分布较窄，近单分散体系；与荧光纳米粒子相比，羊抗N蛋白抗体偶合物、鸡IgY抗体偶合物的Zeta电位绝对值均增大，体系处于更加稳定的状态，电位增大的原因可能是荧光纳米粒子表面共价结合的抗体蛋白也带负电荷。
2.2最低检出限N蛋白浓度与信号值T/C的标准曲线如图4所示，拟合曲线采用2次多项式，
y=0.0367+3.819×10−4x−6.456×10−8x2，R2=0.9991。各浓度N蛋白峰型图如图5所示，峰基线平整，各浓度N蛋白T峰区分明显。60个空白样本结果正态性检验为非正态，故采用95百分位数法，计算出LOB=
7.0pg/ml；60个低值样本结果正态性检验为正态，故参照1.2.4公式，计算出LOD=13.8pg/ml。
热灭活病毒培养物梯度稀释测试，浓度为1.6×102TCID50/ml时，检测20次有19次测试为阳性，1次阴性，故本研究所制备的抗原检测试剂盒检测热灭活病毒培养物的最低检出限为1.6×102TCID50/ml。
2.3交叉反应性16种呼吸道病原体样本信息及测试结果如表2所示，各病原体样本测试COI均<1，结果为阴性，无交叉反应性，表明试剂特异性较好。
2.4重复性测试62.5pg/ml和500pg/ml两个浓度的N蛋白参考品重复性测试结果如表3所示，变异系数分别为4.98%和7.68%，表明试剂重复性较好。
表1荧光纳米粒子及荧光纳米粒子偶合物粒径和Zeta电位
Tab.1Particle size and zeta potential of fluorescent nanoparticles and its coupling
Types of nanoparticles
Fluorescent nanoparticles Goat anti NP protein antibody conjugate Chicken IgY antibody conjugate
610.80±5.66
615.35±1.48
622.15±0.64
PDI
0.15±0.02
0.13±0.01
0.10±0.01
Zeta Potential/mV
−42.95±0.78
−49.25±0.92
−48.05±0.
21
Note：A.Fluorescent nanoparticles；B.Goat anti NP protein antibody
conjugate；C.Chicken IgY antibody conjugate.
图3荧光纳米粒子及荧光纳米粒子偶合物粒径分布图
Fig.3Particle size distribution of fluorescent nanoparticles
and its
coupling
图5各浓度NP蛋白峰型图
Fig.5Peak pattern of NP protein at different concentra⁃
tions
图4NP蛋白检测标准曲线
Fig.4Standard curve of NP protein
2.5临床性能评价希腊ROUMPEA医学实验室临床评估统计结果如表4所示，与RT-PCR检测结果比较，灵敏度为86.36%（19/22），95%CI：65.09%~ 97.09%；特异度为97.01%（65/67），95%CI：89.63%~ 99.64%。其中3例漏检样本，RT-PCR测试CT值均
李含琳为灰区，2例假阳样本测试结果COI分别为2.40和1.06，结果数值分布如图6所示。
用同一批试剂卡对本公司采集的291例健康人鼻拭子样本进行检测，291例样本出现1例假阳性，结果为2.82COI，健康人抗原检测特异性为99.66%（290/291）。
将希腊ROUMPEA医学实验室及本公司测试的健康人样本合并统计，灵敏度为86.36%（19/22），95%CI：65.09%~97.09%，特异度为99.16%（355/
表2交叉反应结果
Tab.2Results of cross reaction
Number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Types of pathogens
Mycoplasma pneumoniae
Chlamydia pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Haemophilus influenzae
Coronavirus OC43
Coronavirus229E
Coronavirus NL63
Influenza A（H1N1）virus
Influenza A（H3N2）virus
New influenza A（H1N1）virus（2009）
Victoria Influenza B Victoria
Yamagata Influenza B Yamagata
Respiratory syncytial virus type A
Respiratory syncytial virus type B
Adenovirus type3
Virus strain number
ATCC15531
ATCC VR-2282，TW-183
−
CMCC（B）26003
GIM1.961
ATCC VR-1558，OC43
ATCC VR-740，229E
BELRESOURCES NR-470
A/PR/8/34（H1N1）
L8-A3/Brisbane/10/2007
A/GZ/GIRD02/2009（2009H1N1）
L2-BV/Heilongjiang/116/2010
B/Guangzhou/GIRD06/09
RSVA/Long
RSVB/GZ/Hecin1704-8
ADV3/GZ/0101/2011
Concentration
−
4.2×102TCID50/ml
1.0×108CFU/ml
3.0×109CFU/ml
−
1.8×105TCID50/ml
5.6×104TCID50/ml
−
1.8×108TCID50/ml
4.2×106TCID50/ml
1.0×106.25TCID50/0.1ml
1.0×105TCID50/ml
1.0×105TCID50/0.1ml
1.0×106.25TCID50/ml
2.4×106TCID50/ml
3.2×108TCID50/ml
Test result/COI
0.36
0.44
0.17
0.48
光谱表征
0.22
0.22
0.28
0.32
0.37
0.60
0.15
0.66
0.26
0.57
0.45
0.31
表3重复性测试结果
Tab.3Repeatability test results
Number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AV SD CV 62.5/（pg·ml−1）
（COI）
1.03
0.98
0.96
1.09
1.05
0.98
1.03
1.07
1.06
1.12
1.04
0.05
4.98%
500/（pg·ml−1）
（COI）
3.92
3.32
3.41
3.47
3.30
3.89
3.27
3.72
3.47
3.97
3.57
0.27
7.68%
表4临床性能评价
Tab.4Results of clinical performance evaluation
YHLO antigen
detection reagent
Positive（+）
Negative（−）
Total
RT-PCR
Positive（+）
19
3
22
Negative（−）
2
65
67
Total
供应链库存管理论文
21
68
89
图6临床测试结果分布
Fig.6Distribution of clinical test results
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