张银志1，肖利文2，杨燕2，孙秀兰1,23
(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214036;2.江南大学食品学院，江苏无锡214036)
摘要 [目的]建立一种检测四环素类抗生素的新方法。[方法]四环素通过两步衍生化后，与氨基化的BS A 上的表位氨基反应，合成T C 2BS A 偶联物。以四环素多克隆抗体-胶体金复合物作为分析探针，四环素完全抗原作为竞争抗原，构建分析体系。[结果]紫外吸收光谱、凝胶谱图和红外光谱均表明人工完全抗原偶联成功。选择柠檬酸三钠加入量1.5m l 生成的胶体金作为该试验继续合成胶体金检测探针的金溶胶。当抗体稀释倍数为1∶100、pH 值为8.70时，金标灵敏度好。金标试纸条检测样品中四环素的检测限量是200μg/L ，检测时间不超过15.0m in 。与E LIS A 法检测样品作对比，采用新法的准确率达100%。探针溶液中加入10%(V/V )保护剂后，试剂条稳定性明显提高。[结论]该研究为四环素的快速检测提供了依据。关键词 四环素；纳米金；检测方法中图分类号 T S207.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)27-11637-03Study of R apid Detection on T etracycline A ntibiotics in Food by U sing G old 2labeled R eagent Strip ZH ANG Yin 2zhi et al (National K ey Lab of F ood Science and T echn ology ,S outhern Y angtze University ,W uxi ,Jiangsu 214036)Abstract [Objective]T he study was to establish a new m eth od for the rapid detection on tetracycline antibiotics.[M eth od]T hrough tw o step derivatiza 2tion ,the tetracycline reacted w ith epitope am in o in am ination BS A to synthesize into T C 2BS A conjugate.W ith the com pound of tetracycline polyclonal anti 2b ody 2colloidal g old as the analysis probe and the com plete antigen of tetracycline as the com petitive antigen ,the analysis system was constructed.[Result ]Ultraviolet abs orption spectrum ,gel chrom atogram and in frared spectrum all sh owed that the artificial com plete antigen was success fully coupled.T he col 2loidal g old generated by adding 1.5m l tris odium citrate was selected as the colloidal g old s olution in the ex perim ent of continu ously synthesizing the col 2loidal g old detection probe of g old s olution.W hen the dilution multiple of antib ody was 1∶100and pH was 8.70,the sensitivity of g old labeled strip was
g ood T he detection lim it of g old 2labeled reagent strip on tetracycline in detected sam ple was 200μ
g/L and the detection tim e was less than 15.0m in.C om 2pared w ith result of detecting sam ples by E LIS A the accurate rate by using new m eth od was 100%.A fter 10%(V/V )protective agent was added into probe s olution ,the stability of reagent strip was im proved obviously.[C onclusion]T he study provided a base for the rapid detection on tetracycline.K ey w ords T etracycline ;Nan o 2g old ;
Detection m eth od
基金项目 国家质监总局立项资助项目(2007IK 136)；江南大学211
师资基金资助项目。
作者简介 张银志(1975-)，男，陕西汉中人，工程师，从事食品安全
检测方面的研究。3通讯作者。
收稿日期 2008206230
四环素类药物是一种广谱抗菌药物[1]，可直接作为一种饲料添加剂投放到饲料中，曾以价格低、抗菌谱广等优点而在养殖业、畜禽业、水生生物等领域中广泛应用[2-5]。在欧盟，四环素类抗生素的使用量占了整个禽畜业中抗生素使用量的65%
[6]
。1990年，欧盟因我国畜禽产品中抗生素残留超
标而停止进口我国畜禽产品[7]。目前关于四环素类抗生素的检测方法有酶联免疫法、薄层谱法、毛
细管电泳法、质谱连用法和高效液相谱法等[8]，但这些方法都需要大型的仪器，价格昂贵，还需要专人管理。近年来也有进口的用于四环素检测的E LIS A 试剂盒面世，但是保存期限短，价格高，远不能满足检测需要。笔者在前人的研究基础上[9-10]
，建立了
用金标免疫层析检测法检测四环素类抗生素的方法，为四环
素的快速检测提供了可能。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 供试材料:A BA 2BAS 抗血清、C DI 2BS A 抗
血清(江苏省苏微微生物研究所提供)；氯金酸(上海化学试剂厂),950m l/L 盐酸四环素标准品(T C.HC l )(购于中国药品生物制品检定所)；丁二酸酐、N2氯丁二酰亚胺(NCS )、水合肼、碳二亚胺盐酸盐E DC (S igma 公司);0.01m ol/L 羊抗鼠二抗P BS 缓冲液,pH 7.4，所用水均为无锡华晶公司超纯水；牛血清白蛋白BS A 、卵清蛋白OV A (华美公司)；四环素多克隆抗体(实验室自制)，纤维膜，金标垫，样品吸收垫，吸水纸。
供试仪器:UV22100紫外扫描仪(北京瑞利公司产品)，磁力搅拌器(IK A 公司)，冷冻离心机5840R (eppend orf 德国)；微
量移液器PIPET M AN (G I LS ON 法国),DE LT A 2320pH 计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司),H 21微型混合器(上海沪西仪器厂)。
1.2 方法
1.2.1 四环素完全抗原的合成[2-5]。
(1)称取20mg A BA ，溶解于2.2m l 浓度0.2m ol/L HC l 溶
液中。避光条件下缓慢滴加3.5m l 0.49m ol/L 亚硝酸钠水溶液,4℃下恒速搅拌1h 。
(2)称取27mg 四环素，溶解于10m l 0.05m ol/L 的硼酸
钠溶液(pH 值8.5，溶有0.15m ol/L 的氯化钠)中。向其中缓慢滴加1.5m l 制备好的重氮化A BA 溶液。4℃下避光反应2
h ，用H 3BO 3溶液将pH 值调至7.4。
(3)称取120mg E DC 、36mg NHS 和100mg OV A ，加入上
述反应液中，室温下恒速搅拌3h 。
(4)将上述反应液转移到透析袋中，以0.01m ol/L 磷酸
缓冲液透析3d ，每天换透析液3次，冷冻干燥，所得粉末保存于-20℃冰箱中备用[9]。
1.2.2 胶体金溶胶的合成[6]。取50.0m l 氯金酸溶液(1.0×10-4g/m l )置于250m l 的锥形瓶中，在磁力搅拌的同时加热至
沸腾，沸腾后迅速加入柠檬酸钠水溶液(浓度为0.01g/m l )
1.50m l ，继续保持沸腾至溶液为清亮橘红时停止加热，继
续搅拌1m in 停止。用紫外-可见光分光光度仪对金溶胶在紫外-可见光范围内(200～700nm )进行扫描，获得金溶胶紫外-可见光吸收光谱，测定最大吸收波长、吸光值和峰宽。
1.2.3 胶体金溶胶标记四环素抗体探针的制备[7]。用Na 2C O 3溶液将金溶胶液体pH 调至9.00，取20.0m l 2.4×10-5m ol/L 的金溶胶溶液，磁力搅拌的同时，缓慢滴加10
μg/m l 多克隆抗体溶液2.0m l ，静置1h 后，在4℃7500r/m in
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2008,36(27):11637-11639 责任编辑 李占东 责任校对 傅真治
冷冻高速离心机中离心40m in，弃上清液，沉淀用0.5m l50.0 mg/m l BS A溶液溶解[8]。
1.2.4 四环素胶体金快速试剂条的组装[9-12]。测试条由金标垫、硝酸纤维膜和样品吸收垫3部分组成。将硝酸纤维素膜与金标垫、样品吸收垫依次相互叠加粘贴于试剂板上。将制备好的金标抗体探针用微量移液器吸取5μl点于玻璃纤维滤膜上端靠近硝酸纤维膜处，自然干燥后备用。活化处理后，微量移液器对硝酸纤维膜进行检测试剂线性包被，下端横线包被完全抗原，检测线浓度为原反应溶液；上端横线包被羊抗兔IgG，浓度为3.3mg/m l，干燥后备用。以宽3.0 mm/条切条后备用。
1.2.5 纳米金快速试剂条的使用方法[13-14]。将纳米金快速试剂条前端直接插入样品提取液中，或者将试纸条平放在桌面上，直接滴入4滴样品提取液。如果样品液中含有四环素，将在C线处出现红，表示阳性；反之，在T线处出现红，表示阴性；如T线和C线均出现浅红线条，表示弱阳性；如T线和C线均无颜，则说明检测试纸条失效。
1.2.6 纳米金快速试纸条的检测。①最低检测限的确定。配制浓度为50、100、150、200、250、30
0和350μg/L四环素标准溶液，用金标试纸条对其进行测定，以检测线位置有红条带出现(阳性)的最低浓度为检测限。②精密度的确定。对100份用E LIS A方法检测为阴性的样品和20份用E LIS A方法检测为阳性的样品进行检测以作比较。③重复性的确定。分别从20个批次的试纸条中随机抽取20根对200ng/m l的四环素溶液和不含四环素的溶液进行检测。④稳定性的确定。将试纸条分别置于常温(10～20℃)、37℃、56℃条件下密封保存，每隔10d用200ng/m l四环素标准溶液检测。
2 结果与分析
2.1 四环素完全抗原结构的鉴定 图1为各样品的紫外扫描吸收光谱。分析中所用T C的浓度为50μg/m l,OV A、T C2 OV A的浓度均为500ug/m l。从图1可以看出，四环素在274 nm和362nm处有2个吸收峰，而OV A的最大吸收波长为278nm，其在300～400nm无吸收。与载体蛋白OV A的紫外吸收图谱相比，结合物的紫外光谱明显具有药物和蛋白叠加的特征，并且相同浓度的结合物和标准蛋白的紫外光谱相比，吸光度明显增高，其原因可能是四环素与蛋白结合导致结合物吸光度增加。通过公式计算得到偶联比为9.3∶1，说明人工完全抗原合成成功。
强捻纱图2为T C2A BA2OV A和OV A凝胶谱图，从图2可以看出，在保留时间为8.323s时，有一个比OV A分子量更大的大分子的峰出现。而在保留时间为9.323s出现的峰与OV A的出峰时间一致。也可以判断人工完全抗原偶联成功。
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图3是T C2OV A和OV A的红外光谱，从图3可以看出，在3600～3200cm-1以及1700～1600cm-1区域具有相似的吸收，这是蛋白质中氨基酸产生的特征峰，说明合成的T C2 OV A化合物具有OV A的特征官能团。与T C的红外光谱相比,T C2OV A的红外光谱在947cm-1和863cm-1处出现了2个明显的四环素特征峰，而OV A在此处无明显吸收，说明T C2 OV A具有T C的特征官能团，由此说明T C2OV A人工抗原偶联成功。2.2 金溶胶的合成 柠檬酸钠还原法是合成水相金纳米粒子的经典方法，金溶胶颗粒尺寸、粒径分布、晶体结构和分散度都受到反应动力学的影响，而影响反应动力学的因素又包括还原剂的用量、反应温度、pH值等。
正交试验表明，粒径为10nm金溶胶的最佳合成条件是50m l的氯金酸溶液(浓度为1.0×10-4g/m l),100r/m in磁力搅拌下，反应最适温度为90～130℃,pH值5～8。加热至110℃，迅速加入柠檬酸钠水溶液(浓度为0.01g/m l)2m l，保持反应温度和搅拌转速不变，沸腾反应5m in，溶液颜刚刚变为清亮橘红后停止反应。按照最优条件得到的金溶胶的粒径10nm，变异系数为14.2%。
由图4可知，金溶胶在紫外区的λmax位于520nm左右，随柠檬酸三钠加入量增加，金溶胶特征峰值先升高后降低，在加入量为1.5m l时达到最高点。结果表明，选择柠檬酸三钠加入量1.5m l生成的胶体金作为试验继续合成胶体金检测
探针的金溶胶。
图1 TC、OV A及偶联物的紫外吸收图谱
Fig.1 The u ltraviolet absorption spectra o f TC,OV A and their con2
jugate
云南仪表厂图2 TC2ABA2OV A及OV A凝胶谱比较
Fig.2 Comp arison o f gel chrom atogram o f TC2ABA2OV A and OV A 2.3 金标多克隆抗体复合物合成分析 将浓度为10mg/L 的四环素多克隆抗体,50.0m l氯金酸溶液柠檬酸三钠加入量为1.5m l生成的金溶胶以及偶联静置30m in以后的复合物溶液进行紫外扫描后叠加至一张图上后可以看出，最下方的1∶100抗原扫描图谱在280nm附近有特征峰出现。与金溶胶复合后，原出现在520nm处的特征峰峰值增高平移至540nm附近，可以初步证明大分子蛋白抗体与金粒子偶联成功。
2.4 试剂条参数的优化
2.4.1 不同条件合成金标检测线信号强度及灵敏度差异。
83611 安徽农业科学 2008年
图3 TC 2ABA 2OV A 红外图谱
Fig.3 The infared spectra o f TC 2ABA 2OV
A
图4 金标多克隆抗体复合物紫外吸光图谱
Fig.4 The u ltraviolet absorption spectra o f colloid al gold polyclonal
antibody
将抗体稀释为1∶100和1∶50倍后进行试验，结果表明，采用上述优化条件所合成的金标，检测线信号强度随缓冲溶液中四环素浓度的增高而呈梯度降低，故采用1∶100的稀释倍数。
2.4.2 抗体加入过程中体系中不同pH 值对灵敏度影响。
通过改变抗体加入时体系的pH 值(9.80,8.70,7.50)发现,pH 值对金标合成和其灵敏度有一定影响，当pH 值为8.70时，灵敏度比pH 值9.80、7.50时要好，故确定pH 值为8.7。
2.5 最低检测限的确定 用试纸条对50、100、150、200、250、300
和350μg/L 的四环素标准溶液进行测定，以检测线位置有红条带出现(阳性)的最低浓度为最低检出量。结果表明，用金标
试纸条检测样品中四环素的检测限量是200μg/L 。
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2.6 稳定性的确定 试剂条的稳定性主要是由金标抗体探
针的稳定性所决定的。作为一种高分子蛋白和金纳米颗粒的复合物，抗体探针分子很容易发生热变性，导致探针失活。所以，选择合适的抗体探针稳定剂，有效保护探针的活性，对提高金标试纸条在检测时的稳定性，延长试剂条的货架期起
到非常关键的作用。分别在常温(10～20℃)、37℃、56℃下
做金标试剂条的稳定性试验。结果表明，探针溶液中加入
10%(V/V )保护剂后，试剂条的稳定性明显提高，常温下试
剂条保存期可达120d (信噪比保留70%以上)。加入保护剂
后，在高温(56℃
)放置20d 抗体探针的信号强度仍可保留70%以上，而对照放置10d ，信号强度降至40%以下。
2.7 重复性的确定 分别从10个批次的试纸条中随机抽取10根试纸条对200ng/m l 的四环素标准溶液进行测定，结果
一致,T 线和C 线都出现了浅红，表示都呈弱阳性；另外从
10个批次的试纸条中随机抽取10根试纸条对不含有四环素
的水溶液进行检测,T 线有,C 线没有，表明检测结果一致呈阴性。
2.8 检测方法准确性的比较 对100份用E LIS A 方法检测
呈阴性样品进行检测后结果全部为阴性，对20份用E LIS A 方法检测为阳性样检测后全部为阳性，表明该方法精密度
高，准确率达100%。
3 小结
目前，食品中四环素抗生素的检测方法很多，但各有其优缺点。该研究表明，金标快速检测试剂条精确性好，灵敏度高、重复性和稳定性好，是一种快速检测食品中四环素的方法。参考文献
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