(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011247258.3
(22)申请日 2020.11.10
(71)申请人 军事科学院军事医学研究院环境医
学与作业医学研究所
地址 300050 天津市和平区大理道1号
(72)发明人 高志贤 王瑜 彭媛 李双
白家磊 韩殿鹏 任舒悦 秦康
宁保安
(74)专利代理机构 北京思创大成知识产权代理
有限公司 11614
代理人 高爽
(51)Int.Cl.十六大报告
G01N 33/58(2006.01)
G01N 33/577(2006.01)
G01N 33/53(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法和试剂盒(57)摘要本发明属于小分子检测领域，涉及一种用于多种小分子同时检测的亲和素‑生物素放大上转换荧光检 测方法和试剂盒。包括以下步骤：S1.将UCNPs ‑COOH与EDC和NHS混合反应，然后加入Biotin ‑PEG ‑NH 2，得到修饰生物素的上转换纳米颗粒UCNPs ‑bio；S2.将UCNPs ‑bio与链霉亲和素避光振荡孵育，得到ABC ‑UCNPs复合物；S3.将多种小分子的完全抗原包被于黑96孔板中；S4.将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入黑96孔板中并进行孵育，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；S5.添加ABC ‑UCNPs复合物，并避光孵育；S6.采用酶标仪读取荧光值。本发明借助ELISA将UCNPs的荧光优势搭配ABC放大系统实现
历史虚无主义了对目标物的多靶标高灵敏检测。权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 112362875 A 2021.02.12
C N 112362875
A过氧化氢浓度
1.一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法，包括以下步骤：
S1.上转换纳米颗粒修饰生物素：将UCNPs-COOH与EDC和NHS混合反应，以实现对羧基的活化，然后，向活化后的UCNPs-COOH分散液中加入Biotin-PEG-NH2，振荡孵育，得到修饰生物素的上转换纳米颗粒UCNPs-bio；
S2.ABC-UCNPs复合物的制备：将UCNPs-bio与链霉亲和素避光振荡孵育，得到ABC-UCNPs复合物；
S3.包被：将多种小分子的完全抗原包被于黑96孔板中，并进行封闭处理；
S4.单抗和小分子竞争：将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入步骤3)处理后的黑96孔板中并进行孵育，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；孵育后进行洗涤；
S5.添加ABC-UCNPs复合物，并避光孵育，孵育后进行洗涤；
S6.读数：采用酶标仪读取荧光值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照S1-S6的方法，检测一系列已知浓度的多种小分子的标准溶液，测得多组荧光值，分别以浓度和荧光值作为横纵坐标作图，得到多种小分子的标准曲线。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤S6还包括：基于标准曲线，计算待检测样品中多种小分子的含量。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多种小分子为三种抗微生物药：磺胺二甲基嘧啶，沙拉沙星和四环素。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S1包括：取0.8-1.2mg/mL UCNPs-COOH与8-12mg/mL的EDC和8-12mg/mL的NHS混合，在37℃的条件下振荡反应0.5-1.5h以实现对羧基的活化，待反应结束后用缓冲液离心洗涤三次；然后，在活化后的1-3mg/mL的UCNPs-COOH的分散液中加入4-6mg/mL的Biotin-PEG-NH2，在37℃振荡孵育8-16h；将得到的反应产物即修饰生物素的上转换纳米颗粒UCNPs-bio离心洗涤，再重新分散在PBS缓冲液中，使其终浓度为1-3mg/mL并放置于4℃冰箱备用。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2包括：首先取1-3mg/mL的UCNPs-bio分散在含0.04％-0.06％Tween-20的PBS缓冲液中超声分散1-5min，再加入1-3mg/mL的链霉亲和素，其中UCNPs-bio与链霉亲和素的体积比为2：2-5；将上述溶液在37℃条件下避光振荡孵育20-40min；得到反应产物ABC-UCNPs复合物，存放于4℃备用。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S3包括：用包被缓冲液将多种小分子的完全抗原按1:3000稀释，按照80-120μL/孔加入黑96孔板中，置于4℃包被8-16h；将包被的96孔板取出，弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次；按照100-150μL/孔加入封闭液并置于37℃孵育0.8-1.2h进行封闭。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S4包括：将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入步骤3)的黑96孔板中并在37℃培养箱中孵育1-3h，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；孵育后弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S5包括：每孔加入80-120μL ABC-UCNPs复合
物，在37℃避光孵育20-40min；孵育后弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次；
步骤S6中，设置酶标仪的激发波长为808nm，发射波长为545nm。
10.一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光试剂盒，包括以下组分：
(1)生物素修饰的上转换纳米颗粒；
(2)链霉亲和素；
(3)生物素化的多种小分子的单抗；
(4)多种小分子的完全抗原；
其中，组分(1)和(2)可共同以复合物的形式提供；
所述多种小分子优选为三种抗微生物药：磺胺二甲基嘧啶，沙拉沙星和四环素。
一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换
荧光检测方法和试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于小分子检测领域，具体地，涉及一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法，以及一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光试剂盒。
背景技术googlemapapi
[0002]抗微生物药有助于动物生长，所以经常被添加在动物饲料中进而残留在食物中。随着养殖业的发展，抗微生物药滥用问题尤为凸显。例如，磺胺类、喹诺酮类和四环素类抗微生物药都是常见的食品污染物，通常会同时残留在鸡蛋、牛奶、蜂蜜等食物中协同威胁人体健康。过量的抗微生物药通过食物在人体内蓄积，使人体肠道菌失调，引起过敏和变态反应，导致细菌耐药性增加，甚至引起各种组织器官癌变。因此，同时检测多种抗微生物药对于环境和食品安全监控的意义重大。
[0003]目前，实现同时检测的主要挑战在于简化检测步骤的同时提高灵敏度。酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)是一种十分常见的免疫测定方法，能较好地实现多种目标物的同时检测。相较于大型仪器方法，如HPLC，GC，HPLC-MS联用等，ELISA法操作简单且不需要复杂的前处理过程，常用于食品分析、环境监测和临床诊断。传统的ELISA，借助酶与底物产
生颜反应进行定量测定。目前的ELISA试剂盒已经很成熟且商品化，但它们的灵敏度均有待提高，因此不适用于分析低浓度靶标。很多研究者对ELISA进行改进以提高灵敏度，比如亲和素-生物素复合ELISA(Avidinbiotincomplex-ELISA，ABC-ELISA)和结合等温扩增进行信号放大的ELISA。还有将ELISA与各种荧光分子或纳米材料结合，以荧光作为信号输出，提高检测灵敏度。常见的有量子点、金纳米颗粒、荧光染料等，但这些荧光ELISA仍存在易受光漂白影响、量子产率低、背景值高、荧光寿命不足等局限性。为了解决上述问题，上转换纳米颗粒被考虑作为一个良好的荧光信号输出元件。
药物靶标发明内容
[0004]针对现有技术的上述缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、稳定性强、操作步骤简便的检测试剂盒和方法，以实现食品中磺胺二甲基嘧啶(SMZ)，沙拉沙星(SAR)和四环素(TC)三种抗微生物药的同时检测。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法，包括以下步骤：
[0006]S1.上转换纳米颗粒修饰生物素：将UCNPs-COOH与EDC和NHS混合反应，以实现对羧基的活化，然后，向活化后的UCNPs-COOH分散液中加入Biotin-PEG-NH2，振荡孵育，得到修饰生物素的上转换纳米颗粒UCNPs-bio；
[0007]S2.ABC-UCNPs复合物的制备：将UCNPs-bio与链霉亲和素避光振荡孵育，得到ABC-UCNPs复合物；
[0008]S3.包被：将多种小分子的完全抗原包被于黑96孔板中，并进行封闭处理；[0009]S4.单抗和小分子竞争：将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入步骤3)处理后的黑96孔板中并进行孵育，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；孵育后进行洗涤；
[0010]S5.添加ABC-UCNPs复合物，并避光孵育，孵育后进行洗涤；分子生物学名词解释
[0011]S6.读数：采用酶标仪读取荧光值。
[0012]本发明检测过程原理图如图1所示。
[0013]本发明检测原理是基于亲和素-生物素-上转换复合物的双重放大，实现对多种小分子，如SM2、SAR和TC三种抗微生物药的同时检测。首先，将UCNPs-bio与SA一起孵育，通过Bio与SA之间高亲合力的牢固结合形成ABC-UCNPs作为信号输出。如图1所示，在96孔黑酶联板上分别包被三种目标物的完全抗原，然后让待测目标物和包被的Aa竞争结合Bio-Ab。洗板后与抗原结合的生物素化抗体留在了酶联板上，再加入图1中合成好的ABC-UCNPs复合物进行孵育，抗体上的生物素和ABC-UCNPs复合物的链霉亲和素结合形成ABC放大，而未结合的ABC-UCNPs复合物则通过洗板除去，最后在808n
m激发下发出545nm的绿光。目标物浓度越低，与抗原结合留在酶联板上的抗体越多，导致能结合的ABC-UCNPs复合物越多，荧光越强。因此UCNPs荧光信号的强度会随着加入的目标抗微生物药浓度的升高而降低，根据这个规律可以定量检测目标物。借助ELISA平台将UCNPs的荧光优势搭配ABC放大系统可以实现对目标物的多靶标高灵敏检测。
[0014]根据本发明，优选地，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照S1-S6的方法，检测一系列已知浓度的多种小分子的标准溶液，测得多组荧光值，分别以浓度和荧光值作为横纵坐标作图，得到多种小分子的标准曲线。
[0015]根据本发明，优选地，步骤S6还包括：基于标准曲线，计算待检测样品中多种小分子的含量。
[0016]本发明中，“多种小分子”指三种以上的小分子，本发明的方法原则上可以检测任何能满足上述检测要求的小分子，根据本发明一种优选实施方式，所述多种小分子为三种抗微生物药：磺胺二甲基嘧啶(SMZ)，沙拉沙星(SAR)和四环素(TC)。
[0017]根据本发明，优选地，步骤S1包括：取0.8-1.2mg/mL UCNPs-COOH与8-12mg/mL的EDC和8-12mg/mL的NHS混合，在37℃的条件下振荡反应0.5-1.5h以实现对羧基的活化，待反应结束后用缓冲液离心洗涤三次；然后，在活化后的1-3mg/mL的UCNPs-COOH的分散液中加入4-6mg/mL的Biotin-PEG-NH2，在37℃振荡孵育8-16h；将得到的反应产物即修饰生物素的上转换纳米颗粒UCNPs-bio离
心洗涤，再重新分散在PBS缓冲液中，使其终浓度为1-3mg/mL 并放置于4℃冰箱备用。
[0018]根据本发明，优选地，步骤S2包括：首先取1-3mg/mL的UCNPs-bio分散在含0.04％-0.06％Tween-20的PBS缓冲液中超声分散1-5min，再加入1-3mg/mL的链霉亲和素，其中UCNPs-bio与链霉亲和素的体积比为2：2-5；将上述溶液在37℃条件下避光振荡孵育20-40min；得到反应产物ABC-UCNPs复合物，存放于4℃备用。
[0019]根据本发明，优选地，步骤S3包括：用包被缓冲液将多种小分子的完全抗原按1: 3000稀释，按照80-120μL/孔加入黑96孔板中，置于4℃包被8-16h；将包被的96孔板取出，弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次；按照100-150μL/孔加入封闭液并置于
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