基金项目
：“十二五”国家科技支撑计划（2012BAK26B04）；质检公益性行业科研专项（201010022）作者简介：胡佳丽，女，硕士研究生研究方向：精神科临床药理学
*
通讯作者：邹明强，男，博士，研究员研究方向：纳米生物及快速
检测装备研究
Tel /Fax ：（010）85747380E-mail ：mingqiangz@sina
胡佳丽1，2，刘小雷2，于东升3，石磊4，李莉1，张帆1，陈艳1，刘彩虹1，邹明强
1*
（1.中国检验检疫科学研究院，北京100123；
2.内蒙古医科大学，呼和浩特010059；
3.内蒙古精神卫生中心，呼和浩特010010；
4.江西出入境检验检疫局，南昌330038）
摘要：目的建立快速、灵敏的头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条检测法。方法
以Eu-SiO 2荧光纳米颗粒作为标记物，共价
偶联于头孢氨苄单克隆抗体，将头孢氨苄-卵清蛋白全抗原和羊抗小鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线，以竞争性免疫抑制反应模式制备了头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条。结果通过优化实验后制备的免疫层析试纸条对头孢
氨苄残留的检测限为25ng ·mL －1，可在30min 内判读结果，与头孢菌素类、青霉素等的12种抗生素均无交叉反应，具有良好
的特异性。结论
本实验所制备的头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条具有操作简便、快速灵敏、便于普及等优点，为该类抗
生素的检测提供了一种新型的检测方法。
关键词：头孢氨苄；Eu-SiO 2纳米颗粒；荧光免疫层析试纸条doi ：10.11669/cpj.2014.12.014
中图分类号：Ｒ917
文献标志码：A
文章编号：1001－2494（2014）12－1067－06
Development of Fluorescent Immunochromatographic Strip for Detection of Cefalexin Ｒesidue
HU Jia-li 1，
2
，LIU Xiao-lei 2，YU Dong-sheng 3，SHI Lei 4，LI Li 1，ZHANG Fan 1，CHEN Yan 1，LIU Cai-hong 1，ZOU Ming-qiang 1*（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine ，Beijing 100123，China ；2.Inner Mongolia Medical Universi-ty ，Hohhot 010059，China ；3.Inner Mongolia National Center for Mental Health ，Hohhot 010010，China ；4.Jiangxi Entry-Exit Inspec-tion and Quarantine Bureau ，Nanchang 330038，China ）ABSTＲACT ：OBJECTIVE To develop a rapid and sensitive fluorescent immunochromatographic strip for the detection of cefalexin
residue.METHODS
The Eu-silica nanoparticles were synthesized by using ＲP-microemulsion technology.The Eu-silica nanoparti-
cles conjugated with cefalexin monoclonal antibody was used as a fluorescent label.The fluorescent immunochromatographic strip for the detection of cefalexin based on competitive inhibition immunoassay format was developed.The cefalexin-ovalbumin and goat anti-mouse IgG were immobilized on the nitrocellulose membrane as the test line and control line.ＲESULTS After experiment optimization ，the developed strip could provide detection results within 30min and the limit of detection of cefalexin was 25ng ·mL －1.There was no cross-reactivity with 12kinds of antibiotics including cephalosporins and penicillin.CONCLUSION The fluorescence immunochroma-tographic strip is rapid ，sensitive ，and easy to operate ，which may be a powerful tool to detect antibiotics in the future.
KEY WOＲDS ：cefalexin ；Eu-SiO 2nanoparticle ；fluorescent immunochromatographic strip
头孢菌素类（cephalosporins ）抗生素是由活性母读者寄语
核7-氨基头孢烷酸（7-amino-cephalosporanic acid ，7-ACA ）接上不同侧链而制成的半合成抗生素［1］。抗菌作用机制
［2］
主要是抑制敏感菌转肽酶活性，
阻碍细胞壁肽聚糖合成，导致细菌细胞壁缺损，水分内渗，菌体膨胀、变形；同时增加细胞壁自溶酶活性，使细菌产生自溶或细胞壁水解而死亡。因具抗菌谱
广、杀伤力强等优点［1］
常应用于畜牧业中，尤以第一代头孢菌素居多。但由于使用方法不当或不遵守
休药期规定等原因，均可造成其在畜牧产品中残留
量超标，给人类健康带来严重危害，如引发过敏反
应、破坏人体微生态平衡、增强细菌耐药性，甚至可
能破坏环境等［3］。针对头孢氨苄残留问题，欧盟［4］
及我国农业部［5］
均明确规定了食品中该药物的最
高残留限量（MＲL ）。所以，
开发一种简便、灵敏的检测技术势在必行。
近年来，已建立多种抗生素残留检测方法，主要包括理化检测法、微生物学检测法、免疫分析法等。理化检测法因检测设备昂贵、程序复杂，一般应用于科研，很难在基层推广应用。微生物学检测法操作简单、价格低廉，在我国基层乳品企业还有应用，但其需要培养微生物，存在检测时间长、人为因素影响
大等缺点。随着现代免疫标记技术的发展，以特异性的抗原-抗体免疫反应为基础的免疫检测产品以其特异性强、简便快速、成本低廉等优势，目前已成为医学快速诊断和食品安全快速筛查等领域的主流研究方向之一。国内外目前主要以ELISA试剂盒及胶体金标记试纸条作为头孢类抗生素的筛查检测手段。
由于荧光光谱的灵敏度高、选择性好，使各种荧光探针的制备日益成为研究者们追逐的热点［6］。镧系元素荧光光谱的最大特征是Stokes位移大，超过200nm，相互之间不会产生干扰，不影响标记物
的活性。本实验采用荧光免疫分析法［7］，即以镧系元素铕（Eu）作为发光物质来标记抗体或抗原检测标本中相应的抗原或抗体。利用反相微乳技术［8］合成了Eu-SiO
2
荧光纳米颗粒［9］，将其与头孢氨苄单克隆抗体结合制备相应的免疫检测探针，用竞争性免疫层析原理制备头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条，用于头孢氨苄的同步快速检测。特异性好，成本低廉，操作简便，适于牛奶及其他畜牧产品中头孢氨苄残留的快速筛查，对食品安全和疾病防控等均具有重要意义。
1实验材料与方法
1.1实验材料与仪器
头孢氨苄（CEX）对照品、碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）、鸡卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）、聚乙二醇（PEG1500）、葡聚糖（Dex，相对分子质量5ˑ105）、羊抗小鼠IgG（美国Sigma公司）；Protein G柱（上海Gibco公司）；25mmol·L－1碳酸盐缓冲液（CB）pH
9.5由Na
2CO
3
与NaHCO
3
配制、10mmol·L－1磷酸
盐缓冲液（PBS）pH7.4由NaCl、KCl、KH
2PO
4
及
博洛尼亚进程
Na
2HPO
4
·12H
2
O配置、Tris-HCl缓冲液pH8.0，其
他化学试剂为分析纯；Eu-SiO
2
复合物纳米颗粒（厦门大学）；封闭液pH7.8由50mmol·L－1tris、HCl、2%BSA、4%蔗糖配制而成；洗涤液pH7.8由50 mmol·L－1Tris、HCl配制而成；保存液pH7.8由50 mmol·L－1Tris、HCl、0.9%NaCl、0.2%BSA、0.05%Tween-20配制而成。
雌性BALB/C纯系小鼠（中国军事科学研究院实验动物中心）。
硝酸纤维素膜（NC膜：Whatman-AE99、Milli-pore-HF90、Millipore-HF135、Millipore-HF180）、玻璃纤维（CESP203000）、吸水垫（CESP223000）；BT－100B数显恒流泵、HD－3紫外检测仪（
上海沪西分析仪器厂有限公司）；喷膜机、切条机（美国Bio-Dot 公司）；3K30型高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；多功能凝胶成像系统（美国Kodak公司）。
1.2头孢氨苄全抗原的制备
由于CEX是小分子物质，为半抗原，具有抗原性，但不具有免疫原性，想要获得半抗原的特异性抗体，必须将其与载体（蛋白质）偶联成全抗原。
参照碳二亚胺法［10］利用EDC及NHS将溶于PBS中的CEX活化，再将活化后的CEX分子偶联到蛋白质载体OVA和BSA上使其形成全抗原，分别作为试纸条包被抗原和用于单克隆抗体的制备。
1.3头孢氨苄单克隆抗体的制备
由于CEX-BSA免疫原性较弱，在免疫动物前要使用佐剂以增强免疫应答。佐剂可以使抗原缓慢释放，吞噬细胞的摄取能力增加，分为FCA和FIA。本实验中使用的FIA，由乳化剂（羊毛脂或Tween-80）和油脂（石蜡油、植物油）混合制成；在FIA中加入分支杆菌（死卡介苗等），则成为FCA。
将上述合成的CEX-BSA全抗原与等量的FCA 乳化，腹腔注射到8周龄雌性BALB/C纯系小鼠体内，间隔2周加强免疫3次（前2次为全抗原与等量FIA乳化、最后1次为全抗原），取小鼠脾细胞与
Sp2/0骨髓瘤细胞在PEG1500作用下融合，筛选阳性杂交瘤，有限稀释克隆化，腹腔注射至经FIA增强免疫5d后的雌性BALB/C纯系小鼠，7d后取小鼠腹水，纯化，即获得抗CEX单克隆抗体IgG［11］。1.4荧光免疫探针的制备
取铕-SiO
2
纳米颗粒0.4mg以CB洗涤、悬浮；加入100μL醛基化Dex混匀，室温避光震荡反应3 4h，以CB洗涤、悬浮；加入CEX单克隆抗体0.1
mg混合，4ħ震荡反应12h。加入NaBH
3
（CN）（终浓度为5mmol·L－1），4ħ震荡反应2 4h，以封闭液封闭过夜后，洗涤液洗涤，悬浮于保存液，置于4ħ避光处储存备用［6］。
1.5免疫层析试纸条的制备
在支撑板上依次贴上NC膜、吸水垫、喷涂有荧光标记抗体的结合垫及已于展开剂中浸润并烘干的玻璃纤维，组装好免疫层析试纸条，见图1。在Bio-Dot XYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti 300非接触式微定量喷头，均匀平行地将CEX-OVA 作为包被抗原（T线）和羊抗小鼠IgG（C线）在NC 膜上喷洒成粗细适中的2条线。置于37ħ控温箱
烘干1h 后取出，用Bio-Dot CM 4000切条机切成4mm 宽试纸条，与干燥剂一起装入铝箔袋中密封保存备用。
1.6竞争性荧光免疫层析方法
以CEX 为检测对象进行竞争性免疫层析实验，考察Eu-SiO 2免疫检测探针的方法学特性［6］。取供
试品滴加于试纸条样品垫适宜位置，层析后在特征激发（320nm ）、发射（620nm ）波长下拍照检测。按照上述方法分别进行灵敏度、特异性及模拟阳性样品检测。当供试品沿试纸条通过毛细作用从下向上虹吸时，根据层析原理，在层析移动过程中，经试纸条检测端，向另一端移动，先后依次经过结合垫、NC 膜上T 线和C 线到达吸水垫。层析后，若C 线不显，则试纸条视为无效；若C 线显，则试纸条视为有效。若C 线显而T 线不显，则测试结果为阳性；若C 、T 线均显，则测试结果为阴性。2结果与分析
2.1竞争性荧光免疫层析条件优化
2.1.1
硝酸纤维素膜的选择在免疫层析快速检测中，
NC 膜作为包被抗原或者抗体的固相支持物，其种类和性质对层析效果有着显著影响［12］
，没有一种NC 膜可作为最佳NC 膜适用于所有快速检测反
应，任何新产品的开发均需重新筛选NC 膜。由于作为包被抗原或者抗体的蛋白质种类繁多，与NC 膜的结合能力也存在差别。NC 膜孔径大小会影响层析条的以下几个方面：层析速度（即检测时间）、灵敏度（即检测限）及非特异性结合（即假阳性）；而不同厂家之间工艺和配方的差异也会对NC 膜
与蛋白质结合能力产生影响。
本实验选择4种不同种类NC 膜制备免疫层析试纸条。首先以不含CEX 供试品进行竞争性荧光免疫层析实验，结果见图2。由图2结果可知，HF135和HF180的C 、T 线均清晰，且基本无背景干扰；后加做灵敏度实验，发现HF135灵敏度更好，因此选择HF135作为后续实验的NC 膜
。
图1头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条结构示意图Fig.1
The schematic diagram of immunochromatographic strip
for Detection of Cefalexin
residue
图2NC 膜类型对头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条检测结果的影响
Fig.2
Effects of NC membrane type on the test results of im-
munochromatographic strips for Detection of Cefalexin residue
2.1.2
包被抗原浓度的影响本实验检测方法采
用竞争性抑制免疫层析法［13］
，即利用荧光标记CEX
单克隆抗体，以CEX-OVA 偶联物包被NC 膜，形成T 线，用于检测供试品中残留CEX 。供试品中若含一定量CEX ，在层析移动过程中与荧光标记CEX 单克隆抗体结合，从而竞争性抑制此荧光标记抗体与NC 膜上包被的CEX-OVA 偶联物结合，使T 线不显，视为阳性结果；反之，若供试品中不含CEX ，层析移动时则无CEX 与荧光标记CEX 单克隆抗体结合物形成，当荧光抗体标记物经层析作用
扁蓿豆继续到达硝酸纤维素膜上包被有CEX-OVA 偶联物的T 线时，与其结合形成CEX-OVA 与荧光标记CEX 单克隆抗体结合物，使T 线显，视为阴性结果。当CEX-OVA 偶联物包被浓度过低，导致T 线过浅，极易出现假阳性结果；而当CEX-OVA 偶联物包被浓度过高，供试品中CEX 竞争性抑制CEX-OVA 偶联物与荧光标记CEX 单克隆抗体结合能力下降，使灵敏度下降。
选择不同浓度CEX-OVA 作为包被抗原喷洒于NC 膜的T 线位置制备免疫层析试纸条。以不含CEX 供试品进行竞争性荧光免疫层析试验：当包被
抗原质量浓度≤0.23mg ·mL －1
时，
T 线颜偏浅（图3）；选择CEX-OVA 质量浓度为0.93和0.46
mg ·mL －1灵敏度实验，当CEX-OVA 质量浓度为0.46mg ·mL －1时，灵敏度更低，因此将0.46mg ·mL －1作为本实验T 线包被抗原浓度。2.1.3
羊抗小鼠抗体浓度的影响分别以不同浓度羊抗小鼠IgG 喷洒于NC 膜C 线位置制备免疫层析试纸条。以不含CEX 供试品进行竞争性荧光免疫层析实验：当羊抗小鼠IgG 质量浓度为≤0.25mg ·mL －1时，C 线显过浅，无法识别试纸条是否有效（图4）；当羊抗小鼠IgG 质量浓度为1.0mg ·
mL －1时，C 线过亮，与T 线亮度相差过大，影响检
测；故本实验选择羊抗小鼠IgG 质量浓度为0.5mg ·mL －1作为C 线包被二抗浓度。2.1.4
荧光标记单克隆抗体层析量的影响以
Eu-SiO 2纳米颗粒标记CEX 单克隆抗体（0.25mg ·mL －1）制备免疫检测探针。取已标记荧光抗体复合
物稀释100倍后，
取不同体积喷洒于玻璃纤维制备免疫层析试纸条结合垫。为以不含CEX 供试品进行竞争性荧光免疫层析实验：当荧光标记单克隆抗
体层析量为2μL 时，T /C 线过浅，无法识别试纸条是否有效；选择原荧光标记单克隆抗体层析量为5
和8μL 时作灵敏度考察，最终选择灵敏度较低5μL 作为玻璃纤维荧光标记单克隆抗体喷洒量，即层析量（图5）。2.1.5
供试品上样量的影响
考察不含CEX 展开
剂不同体积供试品作为上样量对层析检测结果影响。当上样量为50μL 时，背景有干扰；当上样量为150μL 时，在实验过程中发现：宽度为4
mm
图3CEX-OVA 浓度对头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条检测结果的影响
Fig.3
Effects of CEX-OVA concentration on the test results of
immunochromatographic strips for detection of cefalexin
residue
图4羊抗小鼠IgG 浓度对头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条检测结果的影响
Fig.4
Effects of goat-anti-mouse IgG concentration on the test
results of immunochromatographic strips for detection of cefalexin residue
的试纸条玻璃纤维无法承载全部上样量，以至供试
品外溢，影响检测结果（图6）。故本实验选择供试品上样量为100μL 。
2.1.6展开剂优化展开剂在荧光标记快速检测方法的建立过程中非常重要，展开剂中往往需要添加一些非离子型表面活性剂及封闭剂。本实验选择Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）对其浓度进行优化，及是否需要添加BSA 作为封闭剂进行考察。
配置6种展开剂（表1）。含有1.0%Triton X-100、3.0%BSA 、0.2mol ·L －1Tris 的Tris-HCl 缓冲液pH 7.8作为展开剂时，T 线、C 线均较清晰（图7）。2.2方法学考察
抗疟记2.2.1
灵敏度根据竞争性抑制免疫层析试纸条
的反应原理，
C 线显，T 线不显为阳性结果。根据以上优化实验后制备的荧光免疫层析试纸条对不
同浓度CEX 检测结果见图8，当质量浓度≥25ng ·mL －1时，
T 线不再显。
为保证检测结果正确图5
荧光标记单克隆抗体层析量对头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条检测结果的影响
Fig.5
Effects of europium-labeled-CEX-monoclonal antibody
volume on the test results of immunochromatographic strips for detection of cefalexin
residue
图6展开剂不同体积对头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条检测结果的影响
Fig.6
Effects of different volumn developing solution on the
test results of immunochromatographic strips for detection of ce-falexin residue
表1展开剂的组成成分对头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条的影响
帅同社区论坛
Tab.1
Effects of different developing solution composition of
immunochromatographic strips for detection of cefalexin residue
No.Triton X-100BSA Tris-HCl
10.5% 3.0%0.2mol ·L －1Tris pH 7.82 1.0% 3.0%0.2mol ·L －1Tris pH 7.83 1.5% 3.0%0.2mol ·L －1Tris pH 7.840.5%00.2mol ·L －1Tris pH 7.85 1.0%00.2mol ·L －1Tris pH 7.86
1.5%
0.2mol ·L －1Tris pH 7.
8
图7不同组成成分展开剂对头孢氨苄残留荧光免疫层析试纸条检测结果的影响
Fig.7
Effects of developing solution variety and composition on
the test results of immunochromatographic strips for detection of cefalexin
什么是附着力residue
图8CEX 竞争性免疫检测实验Fig.8
CEX Competitive immunoassay test
性，将CEX 荧光免疫层析试纸条检测下限定为25
ng ·mL －1。2.2.2
特异性
交叉反应实验中各抗生素标准
品质量浓度均为100ng ·mL －1
。本实验制备的荧光探针与其他6种头孢菌素类抗生素，和同属β-内酰胺类的青霉素类及大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类及合成类抗生素间均无
无交叉反应，说明其具有较强特异性（图9、10）。2.2.3
模拟阳性样品检测取经ELISA 检测确定
不含CEX 的某品牌纯牛奶加入CEX 标准品使终质
量浓度为100ng ·mL －1
，
2倍等比稀释，于4ħ、4000r ·min －1条件下离心10min ，
取上清液进行
图9头孢菌素类交叉反应检测实验
1－头孢喹肟；2－头孢噻呋；3－头孢哌酮；4－头孢曲松；5－头孢呋辛；6－头孢噻吩；7－头孢氨苄
Fig.9Experiments of cephalosporins cross-reaction
1－cefquinome ；2－ceftiofur ；3－cefoperazone ；4－cefatriaxone ；5－cefuroxime ；6－cefalotin ；7－
cefalexin
图10
头孢氨苄与其他类抗生素交叉反应检测实验
1－磺胺嘧啶；2－氯霉素；3－土霉素；4－庆大霉素；5－红霉素；6－青霉素；7－头孢氨苄
Fig.10Experiments of other antibiotics cross-reaction with Ce-
falexin
1－sulfadiazine ；2－chloroamphenicol ；3－oxytetracycline ；4－gentamicin ；5－e-rythromycin ；6－penicillin ；7－cefalexin
测试，结果见图11，
最低检出浓度仍可达到25ng ·mL －1，与展开剂中灵敏度一致，
且低于欧盟［6］
及我国农业部［7］
关于牛奶中的头孢氨苄最高残留限量（100ng ·mL －1）限定标准，说明该荧光免疫试纸条适用于牛奶中CEX 定性检测。
胶体金免疫试纸条应用于牛奶样品中CEX 的
快速筛查检测限为80ng ·mL －1［14］
，而本实验所制
备的荧光免疫试纸条检测限为25ng ·mL －1
，
较胶体金免疫试纸条灵敏度更高；应用ELISA 试剂盒检测牛奶样品时，虽检测限可达2.5ng ·mL －1
，但其
操作繁琐，
加样后还需滴加其他反应试剂，并且需要孵育，至测得结果至少2 3h ，远不及免疫层析试纸
条加样后仅30min ，便可获得结果及时方便。3
结
论
本实验利用反相微乳技术合成了Eu-SiO 2复合物纳米颗粒，
与CEX 单克隆抗体交联制备免疫检测
豫公网安备41160202000603
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