王媛媛;侯彩玲;王志民
【摘 要】用戊二醛和EDC/sulfo-NHS分别活化表面修饰了氨基和羧基的微球,在2种微球上分别固定相等摩尔浓度的氨基标记的发卡DNA和未经修饰的人TNF α捕获抗体,结果表明戊二醛的交联效果优于EDC/sulfo-NHS.从而选择戊二醛为交联剂将Cy3标记的发卡DNA和未经修饰的藻红蛋白(RPE)分别固定到微米球表面并进行了荧光观察,再通过调整蛋白和DNA的比例将FAM标记的发卡DNA和RPE同时固定到微米球上并观察荧光,为实现用DNA序列编码的微米球上多种生物标志物酶联免疫吸附检测奠定了基础.用RPE为荧光标记物采用双抗体夹心法在微球上进行荧光免疫反应,为商品化诊断试剂的研究提供一定的参考. 【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》
【年(卷),期】2018(036)005
【总页数】7页(P1-6,13)
【关键词】戊二醛;EDC/sulfo-NHS;发卡DNA;人TNF α;藻红蛋白
【作 者】王媛媛;侯彩玲;王志民
【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240
【正文语种】中 文阿部仲麻吕
【中图分类】O631.3
熟人作案微纳米球是一类常用的生物大分子DNA和蛋白质的固相载体。因其表面可用多种活性基团修饰,使微纳米球表面固定生物大分子的方式灵活多样,因此,被广泛应用于生物分子分离[1-2]、生物传感器[3]、医疗诊断[4]和靶向释药[5]等研究领域。共价键结合法是在微纳米球表面固定DNA或蛋白质的最常用方法之一,其他固定的方法还有包埋、吸附、生物素-亲和素作用等[6]。共价键结合通常利用戊二醛[7]或碳二亚胺(EDC)[8]等化学交联剂实现DNA或蛋白的定向耦合。醛基可与胺缩合形成希夫氏碱,戊二醛是一种双功能交联剂,一个醛基可与微纳米球上包被的氨基缩合,另一个醛基可与蛋白质上的伯胺或DNA分子上标记的氨基缩合,实现靶分子的固定。戊二醛与胺的缩合反应具有条件温和、活性高和交联性能好等优点[9],
因此应用广泛。碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺磺酸(EDC/sulfo-NHS)能够催化包被在固相表面的羧基与氨基形成酰胺键[10],从而实现氨基标记的DNA分子或蛋白质的固定,其毒性低、生物相容性好。但这2种交联剂在微纳米球表面固定生物大分子的效率,未见对比分析的报道。
R-藻红蛋白(R-phycoerythrin,RPE)是存在于藻类细胞的水溶性捕光素蛋白藻胆蛋白中的一种[11-14],其作为新型荧光标记物,与FITC等荧光染料相比,具有天然无污染、资源丰富、稳定不易淬灭、非特异性吸附小、荧光强度高、灵敏度高、摩尔消光系数大、背景干扰小和量子产率高等众多特点,在480～570 nm的可见光区有较强的吸收,发射峰位于575 nm[15],目前已广泛应用于流式细胞术、免疫组化和荧光免疫分析[16]等领域。
本文分别用戊二醛活化表面修饰了氨基的微球、用EDC/sulfo-NHS活化表面修饰了羧基的微球,再在活化后的2种微球上分别固定相等摩尔浓度的氨基标记的发卡DNA和人TNF α捕获抗体,比较用戊二醛和EDC/sulfo-NHS在微米珠上固定DNA和蛋白的效果。用戊二醛作为交联剂,将Cy3荧光标记的发卡DNA和藻红蛋白分别固定到氨基微球表面进行荧光观察,再在微球表面同时交联FAM荧光标记的发卡DNA和藻红蛋白,为将来用不同的DNA序列来编码不
同的生物标志物实现高通量免疫检测奠定基础。最后,用双抗体夹心法进行微球上的固相荧光免疫反应,为商品化诊断试剂的研究提供一定的参考。
我的忏悔1 材料与方法
1.1 实验材料
氨基修饰和羧基修饰的2种直径4 μm聚苯乙烯微球(50 mg/mL,1.4×109个/mL)购自德国Micromod。教育部师范司
藻红蛋白(RPE)购于美国BioVision;链霉亲和素标记的RPE (PE-conjugated Streptavidin,SA-RPE)购于生物工程(上海)股份有限公司;人TNFα抗体对试剂盒,人TNFα捕获抗体,人TNFα抗原,生物素标记的人TNFα检测抗体(Human TNFα matched antibody pair kit:Human TNFα capture antibody;Human TNFα antigen;Biotinylated human TNFα detection antibody)购于英国Abcam。
实验中氨基标记的发卡DNA (HP)由生物工程(上海)股份有限公司合成,序列信息如表1。
表1 DNA片段序列信息Tab.1 DNA sequence information名称Name序列SequenceHP5'-ATCAGCGCAACACCCTTATCTTT(-NH2)TTGATAAGGGTGTTGCGCTG-3'Cy3-HP5'-Cy3-ATCAGCGCAACACCCTTATCTTT(-NH2)TTGATAAGGGTGTTGCGCTG-3'FAM-HP5'-FAM-ATCAGCGCAACACCCTTATCTTT(-NH2)TTGATAAGGGTGTTGCGCTG-3'
1.2 实验方法
1.2.1 发卡DNA的制备和电泳检测团队管理的重要性
利用单链DNA链内碱基互补配对,获得发卡结构。采用PCR仪和水浴2种逐步缓慢降温的方式对合成序列HP进行DNA复性。PCR仪中降温程序设置如下:95 ℃预变性5 min;从93 ℃至21 ℃每下降2 ℃保持2 min。水浴中降温的方法为:将水浴锅加温至95 ℃,将装有单链DNA的离心管置于95 ℃水浴锅中预变性5 min;关闭水浴锅,使其自然冷却至常温。复性后获得的发卡结构DNA (HP)暂时保存于4 ℃冰箱待用。
用20%非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(Native-PAGE)检测发卡DNA (HP),220 V恒压下电泳1.5 h。上样前发卡DNA (HP)在37 ℃水浴中保温30 min。未复性的单链DNA作为对照,上样前95 ℃变性10 min后立即放于冰中保持5 min。
1.2.2 发卡DNA (HP)在微球表面的固定
(1)以戊二醛作交联剂的固定:取300 μL氨基修饰的微球室温下8 000 r/min离心5 min,去上清液。用含0.1% Tween-20的0.01 mol/L PBS (PBST)溶液清洗微球2次,去上清液。向微球中加入350 μL 8%的戊二醛(美国Sigma) PBS活化液,室温下振荡混合5 h,8 000 r/min离心5 min,去上清液;用PBST清洗微球2次,重悬于300 μL PBS中。向微球加入10.4 μL 100 μmol/L的发卡DNA (HP),室温下振荡反应过夜,8 000 r/min离心5 min,留上清用于测量上清液中的DNA浓度。用PBST清洗微球2次后,将微球悬浮于300 μL的0.2 mol/L乙醇胺中,室温下孵育30 min以灭活微球上未反应的醛基。清洗微球2次,再将微球重悬于300 μL的PBS中,4 ℃保存待用。
(2)以EDC/sulfo-NHS作交联剂:取300 μL羧基修饰的微球,室温下8 000 r/min离心5 min,去上清液,用PBST溶液清洗微球2次,去上清液。向微球中加入7.5 mL新鲜配置的EDC/sulfo-NHS活化液[称取187.5 mg的EDC (innochem)和187.5 mg的sulfo-NHS (中国adamas)溶解在7.5 mL的100 mmol/L的pH 6.0的MES(百灵威)溶液中)],充分混合均匀,室温下放置30 min,8 000 r/min离心5 min,去上清液。用PBST清洗微球2次,重悬于300 μL PBS中。向微球
中加入10.4 μL 100 μmol/L的发卡DNA (HP),室温下振荡反应过夜,8 000 r/min离心5 min,留上清用于测量上清液中的DNA浓度。清洗微球2次,再将微球重悬于300 μL的PBS中,4 ℃保存待用。nesp
固定前配制的发卡DNA (HP)溶液(取10.4 μL 100 μmol/L的HP用300 μL PBS稀释)和用交联剂固定到2种微球后剩余上清液中的DNA浓度,用分光光度计(Nanodrop Lite)测量。实验进行3次重复。
1.2.3 人TNF捕获抗体在微球表面的固定
向上述方法1.2.2获得的经戊二醛和EDC/sulfo-NHS活化的微球中,分别加入300 μL 50 μg/mL的人TNFα捕获抗体,23 ℃下,摇床过夜;8 000 r/min离心5 min,保留上清液用于后续蛋白质浓度测定,清洗微球2次。分别用10% BSA封闭,清洗微球3次后重悬于300 μL PBS。
用BCA蛋白质定量检测试剂盒(BCA法)测定固定前配制的人TNFα捕获抗体的浓度和经交联剂固定到2种微球后上清液中剩余的人TNFα的浓度。按照BCA蛋白质定量检测试剂盒产品说明书的浓度梯度配制标准蛋白,用多功能酶标仪(Infinite M200 pro)在562 nm下读取OD值并绘制标准曲线,据此计算上述各样品的蛋白质浓度。实验进行3次重复。
1.2.4 用戊二醛在微球上固定荧光标记的发卡DNA (Cy3-HP)
用1.2.2中戊二醛固定HP的方法将10.4 μL 100 μmol/L Cy3标记的发卡DNA (Cy3-HP)固定到300 μL氨基微球上。用移液器取少许微球滴在经水虎鱼溶液清洗的盖玻片上[17],荧光显微镜下成像。
1.2.5 用戊二醛在微球上固定RPE
用1.2.3中所述戊二醛固定人TNFα捕获抗体的方法将300 μL 10 μg/mL的RPE固定到300 μL微球上。用移液器取少许微球滴在经水虎鱼溶液清洗的盖玻片上[17],荧光显微镜下成像。
1.2.6 以戊二醛为交联剂在微球上同时固定发卡DNA和荧光蛋白
采用1.2.3的方法,先将300 μL 6 μg/mL RPE固定到微球上,然后,再用1.2.2的方法,将10.4 μL 100 μmol/L FAM标记的发卡DNA (FAM- HP)固定到微球上,微球滴于盖玻片上,荧光显微镜观察。
1.2.7 以戊二醛为交联剂进行微球上的荧光免疫反应
取2个离心管,各加入300 μL氨基修饰的微珠,经戊二醛活化后,各加入300 μL 6 μg/mL的人TNF α捕获抗体。微球经清洗后,向一个管内加入300 μL 6 ng/mL TNFα抗原,另一管不加抗原作为对照。室温下,在摇床上反应2 h后,用PBST清洗微球3次,各加入300 μL 1.5 μg/mL 生物素标记的TNFα检测抗体,室温下在摇床上反应1 h后,用PBST清洗微球3次,各加入300 μL 12 μg/mL链霉亲和素标记的RPE (SA-RPE),室温和黑暗条件下,在摇床上反应1 h后,用PBST清洗微球6次,重悬于300 μL PBS中,各取2 μL滴于经水虎鱼溶液清洗的盖玻片上,荧光显微镜观察。
2 结果与分析
2.1 发卡DNA的制备
设计的发卡DNA (HP)长度43个碱基,中间连续的5个T为环部,环部中央的T上修饰氨基,5’端茎部20 nt,3’端茎部18 nt。经idt等多个在线软件预测,该核酸序列可以形成预设的发卡结构而不易存在折叠等其他二级结构。
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