综㊀㊀述
黄德智综述，蒲晓允ә审校
(陆军军医大学新桥医院检验科，重庆４０００３７)
㊀㊀摘㊀要：免疫层析技术因其简单㊁方便㊁易操作㊁快速，价格相对低廉，已广泛应用于即时检测(P O C T).随着P O C T检测项目的增多和对已有项目检测定量㊁灵敏度㊁特异度等要求的提高，本文就免疫层析技术的最新发展及其应用，作以下综述. 关键词：免疫层析技术;㊀即时检测;㊀量子点
D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１９．０５．０２２中图法分类号:R４４６
文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１９)０５Ｇ０５９４Ｇ０４文献标识码:A
D e v e l o p m e n t o f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y a n d i t s a p p l i c a t i o n i nP O C T
HU A N GD e z h i,P UX i a o y u nә
(D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,X i n q i a oH o s p i t a l,A r m y M e d i c a l
U n i v e r s i t y,C h o n g q i n g４０００３７,C h i n a)
A b s t r a c t:I m m u n o c h r o m a t o g r a p h y h a sb e e nw i d e l y u s e d i nP O C Tb e c a u s eo f i t s s i m p l i c i t y,c o n v e n i e n c e, e a s y o p e r a t i o n,r a p i d i t y a n d r e l a t i v e l y l o w p r i c e．W i t h t h e i n c r e a s eo fP O C Tt e s t i n g i t e m s a n d t h e i n c r e a s eo f t h e r e q u i r e m e n t s f o r q u a n t i f i c a t i o n,s e n s i t i v i t y,a n d s p e c i f i c i t y o f e x i s t i n g p r o j e c t s,t h i s p a p e r r e v i e w s t h e l a t e s t d e v e l o p m e n t s a n d a p p l i c a t i o n s o f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y．
K e y w o r d s:i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y;㊀P O C T;㊀q u a n t u md o t s
１㊀免疫层析技术简介
㊀㊀免疫层析技术是在２０世纪６０年代在发达国家兴起并被用于检测血清蛋白的一种结合了免疫技术和谱层析技术的快速检测分析方法，利用胶体金㊁胶体碳㊁磁性纳米材料㊁稀土纳米材料㊁量子点等着标记物，在层析时，标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显于硝酸纤维素膜
上的检测线，以纤维膜上显条带的有无㊁颜深浅和反射光线来定性或定量，在即时检测(P O C T)中应用极为广泛.免疫层析试纸条由样品垫㊁结合垫㊁硝酸纤维素(N C)膜㊁检测线(T线)㊁质控线(C线)㊁吸水垫㊁聚氯乙烯(P V C)底板等部分组成，根据待检测物的大小和抗原抗体结合的方式，分为双抗体夹心法和竞争法[１Ｇ２].２㊀免疫层析技术发展及应用
㊀㊀免疫层析技术关键在于依靠标记抗体的免疫标记材料，而纳米材料由于优越的信号放大作用，能达到良好的灵敏度和特异度而备受青睐.下面主要从胶体碳㊁量子点㊁稀土纳米材料㊁上转换发光技术和超顺磁性纳米材料以及适配体等方面进行介绍.２．１㊀胶体碳㊀与胶体金相比，胶体碳的优点包括更高的颜强度，即更高的灵敏度和标记效率，动力学检测范围更广，成本低廉，制作工艺简单，可大规模生产且更环保，但由于其标记和封闭时间长，并未体现出对胶体金的绝对优势，故其商业化程度较低[３Ｇ４].何卓等[３]利用碳纳米颗粒制作的胶体碳试纸条用于检测疟原虫，并可通过扫描检测带灰度值以定量.最近,Y U等[４]利用一种新的胶体碳材料氧化石墨烯作为标记物，成功制作出用于检测B１的试纸条，肉眼最低检测限可达０．３n g/m L.材料学的进步能促进检测的进步，诸如碳量子点和石墨烯量子点等材料也是免疫层析研究中可以利用的标记材料.２．２㊀量子点㊀量子点被认为是免疫层析中最有前途的荧光半导体纳米材料，与一般荧光染料相比，量子点具有尺寸可调的荧光，发射光谱窄而对称，高量子产率，宽吸收光谱，荧光强度高，耐光漂白和稳定性好等优点[５Ｇ６].水溶性量子点表面富含羧基或氨基以用于连接蛋白质.表面是羧基的量子点被１Ｇ(３Ｇ二甲氨基丙 基)Ｇ３Ｇ乙基碳二亚胺盐酸盐(E D C)和NＧ羟基琥珀酰亚胺(N H S)激活，并且这些激活的羧基和抗体的氨基相连接.这些特性使得量子点是一个可以达到高灵敏度和同时对多种检测物定量的免疫层析标记物[７].为了检测样本中不同的物质，有两种不同模式的检测方法.第一种模式是不同的T线去检测与之对应的分析物；第二种模式是一条T线去检测不同的分析物.例如，第一种模式,T A R A N O V A等[８]设计了一种 交通信号灯 式的竞争性免疫层析方法，他们
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ә㊀通信作者,EＧm a i l:１５８０９３２０＠q q．c o m.
㊀㊀本文引用格式：黄德智，蒲晓允．免疫层析技术的发展及在P O C T中的应用[J]．国际检验医学杂志,２０１９,４０(５):５９４Ｇ５９７．
使用的多彩的量子点作为标记物以同时检测牛奶中的氧氟沙星㊁氯霉素和链霉素，有６２５㊁５８５㊁５２５n m 的３种不同发射峰的水溶性量子点被用于制作成３条不同颜的检测线，分别是红㊁黄和绿.在这种 交通信号灯 式的检测方法中，氧氟沙星㊁氯霉素和链霉素的检测限分别达到了０．３０㊁０．１２㊁０．２０n g/m L，比酶联免疫吸附试验(E L I S A)方法的检测限低了８０~２００倍.第二种模式,WA N G等[７]设计的一种以多量子点为标记物的双抗体夹心免疫层析试纸条，这
种试纸条只有一条T线，可同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原，检测限分别为３㊁２n g/m L.虽然量子点有诸多优点，但量子点也有缺点.例如，量子点在生物环境下化学性质和胶体性质的不稳定性可能会导致定量不准确.所以，最近已经有几个研究小组都已经开发了一种新的方法，把量子点包被到纳米颗粒表面或里面形成量子点微球，以提升其化学和胶体稳定性，并借此通过量子点的数量来扩大检测信号[８Ｇ９].丁乔棋等[１０]以羧基化C d T e/Z n S e量子点荧光微球为标记物制作的免疫层析试纸条检测牛奶中的氯霉素，检出限为０．１μg/L.量子点提高稳定性后，在多联检测上是很有前途的纳米材料.２．３㊀镧系元素㊀镧系元素是第５７号元素镧到７１号元素镥共１５种元素的统称，用符号L n表示，镧系元素和免疫层析技术相结合形成时间分辨荧光免疫分析层析技术(T R F I C A)[１１].与传统荧光标记物相比，镧系元素有独特的荧光特性：荧光寿命长，激发光和发射光的波长差(s t o k e s位移)大，激发光谱和发射光谱无交叉，特征峰非常尖锐，标记物体积小(原子标记)，标记物不会影响被标记物(尤其对蛋白质的影响小)的空间立体结构，保证了被检物质的稳定性，且可以实现多位点标记等特点.通过有效利用波长分辨和时间分辨技术排除非特异荧光，实现了高信噪比和灵敏度，以时间分辨技术测量特异荧光，对待检物质进行定量分析，解决了普通荧光分析中材料和样品中非特异荧光产生的高背景问题，其中E u最为常用[１２Ｇ１３].L I A N G等[１４]用E u３＋敖合的聚苯乙烯微球作为标记物制作的时间分辨荧光免疫层析试纸条以检测甲胎蛋白，该研究小组是以T线荧光值/C线荧光值(H T/H C比率)来定量检测甲胎蛋白，以H T/H C 比率来定量可以消除试纸条之间的固有异质性和检测标本的基质效应，使得结果准确性和重复性更好.最后该小组检测甲胎蛋白的线性范围达到１．０~１０００．０I
U/m L，最低检测限达到了０．１I U/m L，与商用的化学发光试剂盒结果符合性优异.同样地,T RＧF I C A一样可以实现一个试纸条检测多种物质. WA N G等[１５]用竞争法，在N C膜上划了１条C线和３条T线,３条T线分别用于检测３种不同的βＧ受体激动剂：盐酸克伦特罗㊁莱克多巴胺㊁沙丁胺醇.理论上讲,T R F I C A的灵敏度可以达到１０~１８m o l/L，但在现有的研究中还不能达到，所以以后的研究仍须进一步发挥其高灵敏度的优势.
２．４㊀上转换发光技术㊀上转换发光技术即以稀土金属元素(主要是镧系)构成的纳米或亚微米颗粒作为标记物的免疫层析技术[１６].上转换发光材料在红外激发光下可发射出不同波长的可见光，使其具有抗光漂白能力强㊁反斯托克斯位移宽㊁毒性低㊁背景荧光干扰小㊁发光特性稳定等有点，在免疫检测中可提高灵敏度和信噪比，尤其适用于复杂样本的检测[１７Ｇ２０].雷萌等[２１]研制基于上转换纳米荧光快速定量检测降钙素原的免疫层析检测技术，最低检测限为０．０２n g/m L，线性范围为０．０５~４４．００n g/m L.基于上转换发光尤其适用于复杂样本的检测的特点，可以开发基于上转换发光的多联检测试纸条.
２．５㊀磁性纳米微球㊀在传统的免疫层析方法中，定量主要依赖于测试仪去读取可见光或荧光，但这种方法的劣势就是只能检测到膜表面及以下１０μm这部分的可见光或荧光.然而，通常N C膜的厚度一般是数百微米，分析物在层析时，从膜表面到底部均有指示物质的分布，这样就造成了多达９０％或以上的指示物质未被肉眼或光学仪器所测量到，这对于检测的灵敏度是个极大的损失.而基于超顺磁
纳米颗粒(MN P s)作为标记物的免疫层析方法，利用磁信号分析仪(MA R)可以实现对膜上信号的完整读取，不用去考虑膜的厚度问题，这样可以把灵敏度提高１０~１０００倍，而且试纸条在长时间放置后磁信号并不会有明显损失，生物材料中有鲜有磁信号，因此，对试纸条的干扰很小，所以这样的方法可以达到很高的灵敏度㊁准确性和稳定性[９,２２Ｇ２３].基于超顺磁纳米颗粒的免疫层析法，定量的检测模式有两种：第一种模式是在振荡的磁场中，用巨磁阻传感器去检测T线上所有磁性纳米颗粒的磁化饱和强度；第二种模式是在磁场中，利用磁信号检测仪去扫描N C膜上各个部分以得到磁通量[９].然而两种模式使用的检测仪器不适宜普及,WU等[２４]利用智能手机的相机和成像技术把质控线和检测线上的磁珠抗体颜强度转化成数字信号来给尿液中的定量.G O N G等[２５]也利用磁性微球建立了同时检测心肌肌钙蛋白I和肌酸激酶同功酶(C KＧM B)的方法，最低检测限达到了０．０４９n g/m L和０．０８５n g/m L.这也为以后用磁性微球建立免疫层析的方法做出了一定的指引，可以利用身边的智能设备如手机等作为检测设备，做到更加高效快速的检测.
２．６㊀适配体㊀传统的免疫层析法用抗体作为标记物和捕获物，现在随着指数富集的配基系统进化技术(S E L E X)的应用，配对的适配体也逐渐筛选出来.适配体相对于传统的抗体来讲，具有诸多的优势：筛选周期短，亲和力和稳定性高，特异度强，重复性好，易于合成和修饰，成本低，易于保存，无免疫原性和毒
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国际检验医学杂志２０１９年３月第４０卷第５期㊀I n t J L a bM e d,M a r c h２０１９,V o l．４０,N o．５
性，可与细胞㊁重金属㊁蛋白质㊁细菌和病毒等靶标适配[２６Ｇ２７].A HMA DR A S T O N等[２８]利用S E L E X筛选丝氨酸蛋白酶抑制剂的同源适配体结合胶体金技术检测丝氨酸蛋白酶抑制剂，在溶液和血清中的检测限分别达到了０．１３７n m o l和０．１０５n m o l.WU等[２６]也首次用适配体检测玉米赤霉烯酮，检测限达到了２０n g/m L.由于适配体的诸多优点以及S E L E X技术的逐渐成熟应用，在免疫层析上用适配体来代替抗体检测是一个好的方向.
３㊀结论和展望
㊀㊀本综述介绍了免疫层析法的设计组装㊁反应原理及主要标记物种类和在P O C T的应用，包括床旁检测㊁食物检测和环境监测等.经过几十年的发展，从最初的胶体金，到后来的胶体碳㊁量子点㊁稀土发光材料㊁上转换发光材料㊁超顺磁纳米微球和适配体等，以及本文中还未提及的脂质体等材料，各种材料都被人们发现并运用，使得免疫层析得到长足的发展和广泛应用.定量㊁提高灵敏度㊁多联检测和环保是未来依然要努力的方向.总之，多种多样的标记材料已经在免疫层析法上有所使用，也各自展现了自己的优势和劣势，应进一步对此深入研究，以使得其更好地应用于临床检测㊁食品检测和环境监测等.
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e c t r o n,２０１７,９３:２１Ｇ２５．最爱的人是你
(收稿日期:２０１８Ｇ０９Ｇ２０㊀修回日期:２０１８Ｇ１２Ｇ１６)
综㊀㊀述
脱落滋养层细胞在产前诊断中的应用研究进展∗
李㊀丹综述，兰风华审校
(厦门大学附属东方医院全军检验医学研究所临床遗传与实验医学科，福建福州３５００２５)
㊀㊀摘㊀要:㊀产前诊断为在出生前预测胎儿是否患有某些遗传性疾病或先天畸形的方法，又称宫内诊断.诊断时间越早，操作创伤性越小，对孕妇及胎儿越有利.通过微创方法收集宫颈脱落滋养层细胞，对其进行形态学㊁免疫学㊁遗传学等分析，可确定其胎源性来源并实现孕早期胎儿遗传病的诊断，从而达到产前诊断早期㊁微创的目的.本文就近年来基于宫颈脱落滋养层细胞的微创性产前诊断进展做一综述.
关键词：产前诊断;㊀滋养层细胞;㊀遗传分析;㊀先天畸形;㊀宫颈
D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１９．０５．０２３中图法分类号:R７１５．５
文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１９)０５Ｇ０５９７Ｇ０４文献标识码:A
A d v a n c e s i n t h e a p p l i c a t i o no f t r a n s c e r v i c a l t r o p h o b l a s t c e l l s i n p r e n a t a l d i a g n o s i s∗
L ID a n,L A NF e n g h u a
(D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lG e n e t i c s a n dE x p e r i m e n t a lM e d i c i n e,P L AI n s t i t u t e o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y
M e d i c i n e,D o n g f a n g H o s p i t a lA f f i l i a t e d t oX i a m e nU n i v e r s i t y,F u z h o u,F u j i a n３５００２５,C h i n a)
A b s t r a c t:㊀P r e n a t a l d i a g n o s i s i s a na p p r o a c ho f p r e d i c t i n g w h e t h e r t h e f e t u sh a s c e r t a i n g e n e t i cd i s e a s e s o r c o n g e n i t a lm a l f o r m a t i o n s b e f o r e b i r t h,a l s o k n o w n a s i n t r a u t e r i n e d i a g n o s i s．T h e e a r l i e r t h e d i a g n o s i s i s,t h e l e s s t r a u m a t i c t h e o p e r a t i o n i s,a n d t h em o r eb e n e f i c i a l t o p r e g n a n t
w o m e na n d f e t u s e s．
B y c o l l e c t i n g c e r v i c a l e x f o l i a t e d t r o p h o b l a s t c e l l s b y m i n i m a l l y i n v a s i v em e t h o d a n d a n a l y z i n g t h e i rm o r p h o l o g y,i m m u n o l o g y a n d g eＧn e t i c s,w e c a nd e t e r m i n e t h e i r f e t a l o r i g i n a n d r e a l i z e t h e d i a g n o s i s o f f e t a l g e n e t i c d i s e a s e s i n e a r l y p r e g n a n c y, s o a s t o a c h i e v e t h e g o a l o f e a r l y a n dm i n i m a l l y i n v a s i v e p r e n a t a l d i a g n o s i s．I n t h i s p a p e r,w e r e v i e wt h e p r oＧg r e s s o fm i n i m a l l y i n v a s i v e p r e n a t a l d i a g n o s i s b a s e do n c e r v i c a l e x f o l i a t i v e t r o p h o b l a s t c e l l s i n r e c e n t y e a r s．
K e y w o r d s:p r e n a t a l d i a g n o s i s;㊀t r o p h o b l a s t c e l l s;㊀g e n e t i c a n a l y s i s;㊀c o n g e n i t a lm a l f o r m a t i o n s;㊀c e r v iＧc a l
㊀㊀产前诊断是降低遗传缺陷新生儿出生率最重要的方法，其金标准为羊膜腔穿刺获取羊水中胎儿细胞行产前遗传分析，但因其操作的有创性㊁致流产风险和诊断时间位于孕中晚期等原因仍难以为广大孕妇所接受.通过微创的方式获得胎儿遗传物质及早期的产前诊断技术是该领域研究者追求的目标.宫颈脱落滋养层细胞取材安全㊁便利，是产前诊断技术微创化的重要备选来源之一，且其可将诊断时间提早至
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国际检验医学杂志２０１９年３月第４０卷第５期㊀I n t J L a bM e d,M a r c h２０１９,V o l．４０,N o．５
∗基金项目：福建省科技引导性项目(２０１６Y００７１).
㊀㊀本文引用格式：李丹，兰风华．脱落滋养层细胞在产前诊断中的应用研究进展[J]．国际检验医学杂志,２０１９,４０(５):５９７Ｇ６００．
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