金艳丹;栗慧;张岩蔚;魏东
【摘 要】为在制备盐酸克伦特罗和水溶性羧基量子点偶联物,给荧光快速检测技术的研究提供良好的依据.实验采用EDC/NHS两种偶联剂将二者共价偶联到一起,并经紫外扫描法、荧光扫描、斑点法、荧光免疫分析法对二者偶联效果进行了鉴定,结果表明,量子点和抗体偶联成功,偶联后吸收峰变宽、吸光度变大、荧光强度增加、抗体效价稍低,但不影响试验结果,可为盐酸克伦特罗药物的多残留试纸条及试剂盒的开发提供良好的参考依据. 【期刊名称】《中国兽医杂志》
【年(卷),期】2018(054)001
【总页数】网络拓扑图4页(P43-46)
【关键词】量子点;盐酸克伦特罗多克隆抗体;偶联物黑箱法
【作 者】金艳丹;栗慧;张岩蔚;魏东
【作者单位】河北省农产品安全检测重点实验室,河北张家口075000;河北北方学院食品安全研究中心,河北张家口075000;河北省农产品安全检测重点实验室,河北张家口075000;河北北方学院食品安全研究中心,河北张家口075000;河北省农产品安全检测重点实验室,河北张家口075000;河北北方学院食品安全研究中心,河北张家口075000;河北省农产品安全检测重点实验室,河北张家口075000;河北北方学院食品安全研究中心,河北张家口075000黑龙江省畜牧兽医局
【正文语种】沙能奶山羊中 文
温州医学院王静门【中图分类】Q657.39+
盐酸克伦特罗又称“瘦肉精”(CL)，是白或类白晶体粉状，无嗅、味微苦，化学性质较为稳定，属于苯乙醇胺类β2肾上腺类神经兴奋剂。它有较强的药性，化学性质稳定，溶解代谢率低，不易排出，残留量较高，大量用在饲料中可增强脂肪分解，肉迅速增长，大大提高了瘦肉率，增加瘦肉产量，虽说农药、饲料添加剂、动物激素等在一定剂量范围内使用，可以为畜牧业和经济的发展起一定的促进作用，但当其在生物体内含量超过临床用量的5～10倍时，便会导致畜禽中毒和大量药物残留，带来了相应的安全隐患[1]。研究表明，过多食用含有瘦肉精的肉制品对人体某些机能损害极大，易使人出现肌肉震颤、心悸
、呕吐等症状，特别是对高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，严重的可导致死亡[2]。因此，研究一种高效、快速、简捷的检测盐酸克伦特罗类兴奋剂药物残留的方法是目前关键任务。
目前, 已经有多种技术可以对盐酸克伦特罗瘦肉精残留进行较为灵敏的检测。主要有高效液相谱[3]、微生物法[4]、酶联免疫吸附法[5]、胶体金免疫法[6]等，其中高效液相谱法已成为多个国家主要的检测方式，但该方法前处理比较复杂，所需仪器昂贵，难以普及。微生物法检测线过高，灵敏度低，特异性差，适合于初级的筛选也无法广泛适用。酶联免疫吸附法目前虽备受关注但也存在费时、费力等缺点，无法实现现场快速检测[7]。胶体金层析法虽比其他方法更适用但对于残留量较低的半抗原抗体物质仍旧很难进行定量分析，且很不能用肉眼观察，极大地限制了他的应用[8]。而近年来新兴的半导体纳米荧光材料量子点逐渐被人们开发作为荧光材料标记抗体，与传统的有机染料相比激发光谱宽，颜可调，稳定性好，荧光强度高[9]。与胶体金相比量子点能检测出含量较低的抗原抗体，灵敏度更高，更适用于药物残留的基层检验和大量样品直接现场检测[10]。在免疫层析技术中，量子点与大分子物质偶联是建立荧光免疫层析法的基础，因此本试验主要以盐酸克伦特罗为研究对象，针对量子点的荧光性和抗体的生物功能，采用EDC/NHS偶联剂将二者共
价偶联到一起，并经紫外扫描法、荧光扫描、斑点法及免疫法对二者偶联效果进行了鉴定，为新型免疫层析法和多残留检测试剂盒的研制打下了坚实的基础。
1 材料
1.1 试剂 盐酸克伦特罗、碳亚二胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG，Sigma 公司生产；羊血清、盐酸克伦特罗完全抗原、盐酸克伦特罗多克隆抗体，河北北方学院实验室自制；水溶性羧基量子点，北京北达聚邦量子点有限公司生产；TMB单组份显液，北京索莱宝科技有限公司生产；其他试剂均为分析纯由国药集团有限公司生产，本次试验所用水均为超纯水。 1.2 仪器 手持移液器(Research Plus系列)，艾本德国际贸易有限公司生产；电子精密天平(JJ323BC)常熟市双杰测试仪器厂生产；台式高速离心机(TGL-16A)，金坛市仪都仪器有限公司生产；紫外分光光度计(Lambda 365)，韩国生产；荧光分光光度计(F-7 000)，日本岛津生产；微孔板恒温孵育箱(ST70-2)，深圳市优米仪器设备有限公司生产；恒温鼓风干燥箱(FX101-3)，上海树立仪器仪表有限公司生产；NC膜(0.8 μmol/L)，上海金标生物科技有限公司生产；酶标仪(Multiskan Mk3型)，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。
2 方法
2.1 量子点和盐酸克伦特罗抗体偶联 用注射器取600 μL水溶性羧基量子点溶液(2.5 μmol/L)加入1 mL的PBS(磷酸盐缓冲液)(pH值=7.0) 搅拌均匀，边搅拌边加入300 μL EDC(6 mg/L),将量子点活化20 min后加入100 μL NHS(6 mg/L)，继续28 ℃下搅拌20 min，最后加入750 μL盐酸克伦特罗多克隆抗体溶液，于28 ℃反应2.5 h。反应结束后将偶联物用超滤离心管在12 000 r/min条件下离心3 min，将样品反复浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，最后置于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中于4 ℃避光保存。
2.2 偶联效果的检测
2.2.1 紫外分光光度计分析 将量子点和量子点标记抗体偶联物用PBS(pH值=7.0)稀释到一定浓度，在波长为400～700 nm范围内用UV3 900紫外扫描仪分别进行扫描，观察量子点和量子点抗体偶联物之间吸光度以及吸收光谱的变化。
2.2.2 荧光分光光度计分析 将量子点和量子点标记抗体偶联物用PBS(pH值=7.0)稀释到一定浓度，激发波长为540 nm，狭缝为10 nm，发射波长在400～700 nm范围内分别用荧光分光光度计扫描仪分别进行扫描，测定荧光强度，观察两者之间的变化。
托尔斯泰主义
2.2.3 斑点印迹法 将6 mg/mL CL-OVA点在NC膜上，干燥后用含3% 羊血清的PBS(pH值=7.0)封闭膜上未反应的蛋白结合位点，放置37 ℃恒温孵育箱中孵育1h，取出，用PBS或PBST反复洗涤膜。用相同方法制备2个印迹膜，干燥后依次滴加QDS-CL和QDS，于 37 ℃ 孵育器中反应25 min，用PBS(pH值=7.0)反复冲洗干净，用365 nm紫外灯观察图像。
2.2.4 荧光免疫学法 根据间接荧光免疫分析法测定已标记水溶性羧基量子点的盐酸克伦特罗多克隆抗体效价，具体步骤如下：包被、封闭、荧光抗体、二抗、显、终止、最后在450 nm下测OD值。
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