崔运利
【摘 要】@@ 胶原蛋白具有能够形成高强度的不溶性纤维、低免疫原性等特点[1],这些特点使其成为构建组织工程软骨支架较为理想的材料,但单纯以胶原蛋白为材料所构建的组织工程支架,其降解速度较快,强度也比较差,不能达到作为种子细胞支架的要求.因此,需要对胶原蛋白进行改性以提高支架的性能. 【期刊名称】《重庆医学》
【年(卷),期】2010(039)020
【总页数】3页(P2790-2792)
【关键词】组织工程;胶原蛋白;化学交联技术
【作 者】崔运利
网上家长学校校信通【作者单位】第三军医大学西南医院关节外科中心,重庆,400038
【正文语种】中 文
【中图分类】R318%TB18
至于夏水襄陵
襄樊晚报胶原蛋白具有能够形成高强度的不溶性纤维、低免疫原性等特点[1]，这些特点使其成为构建组织工程软骨支架较为理想的材料，但单纯以胶原蛋白为材料所构建的组织工程支架，其降解速度较快，强度也比较差，不能达到作为种子细胞支架的要求。因此，需要对胶原蛋白进行改性以提高支架的性能。许多实验证明，应用物理和化学交联剂等改性胶原蛋白的方法均可以使胶原蛋白支架在强度和抗水解能力等方面明显提高。其中使用物理交联法可以避免外源性有毒物质进入胶原蛋白内造成影响，但是物理改性胶原蛋白的方法交联度很低，且常常使交联的材料发生变性和一些不明确的不良反应，因此，常作为辅助方法。化学交联法可以使胶原蛋白支架性能明显提高，而且用于交联的化学交联剂种类多，但化学交联剂本身或其反应产物常常具有细胞毒性等不良反应，或者其交联条件非常苛刻，使得每种化学交联剂在实际的应用中都或多或少存在一定的局限性。因此，在实际的应用中，应根据实验目的，把上述诸多因素考虑进来进行化学交联剂的选择。总之，无论使用哪种交联剂进行交联，理想的交联效果应是交联后的胶原蛋白具有良好组织相容性，对接
种在其上面的种子细胞无任何不良反应，并且交联后的胶原蛋白在耐热性能、变性温度、抗水解能力、力学强度方面均能有所提高，同时减慢胶原酶的降解速度和降低其遇水膨胀度。
1 化学交联法
1.1 醛类 戊二醛(glutaraldehyde，GTA)是带有刺激性气味的无透明油状液体，在组织工程中应用较早且十分常用的一种化学交联剂，它可以明显提高交联后胶原蛋白支架的强度和解链温度，有较好的交联效果，并且价格低廉。GTA的作用机制是与胶原蛋白中的自由氨基反应形成化合物。Chajra等[2]应用GTA与EDC/NHS交联胶原蛋白并对它们的交联效果进行对比，发现使用GTA交联的胶原蛋白海绵支架强度比用EDC/NHS交联的效果好，而且用GTA交联的胶原蛋白海绵支架的羟基磷灰石含量更适合骨软骨的修复。然而，虽然GTA能提供有效交联，明显改善胶原蛋白支架的机械性能，但大量研究证实GTA有明显的细胞毒性，少量的GTA残留就会对其周围的细胞产生不良反应，且GTA具有变应原性特性。因此，目前已较少作为交联剂应用于组织工程，由于其有较好的交联效果，常作为其他交联剂交联效果好坏的对照。
1.2 异氰酸盐类 1，6-己二异氰酸酯(hexamethylene diisocyanate，HDI)是一种脂肪族的双官能团异氰酸酯，为透明无液体，稍有刺激性气味，也可以用作胶原蛋白的交联剂，并且有较好的交联效果。Naimark等[3]用H DI对胶原蛋白进行交联，发现HDI交联能显著提高胶原蛋白的机械性能，并且同时还可降低钙化度。但 Luyn等利用甲基纤维素培养系统对HDI的细胞毒性进行研究，发现有中度细胞不良。因此，由于异氰酸盐类具有明显的细胞不良反应，近年在组织工程支架应用中用其来改性胶原蛋白的研究已经很少，但如果使用HDI进行胶原蛋白交联，应该使用有效的清洗方法来去除对细胞有不良反应的物质。
1.3 京尼平(genipin) 是从栀子果实中提取的活性化合物，性状为白晶体，是一种很好的胶原蛋白和壳聚糖的天然交联剂，目前，京尼平在生物组织和生物材料等方面应用较多，很多文献报道应用京尼平对胶原蛋白进行交联可以在机械强度方面获得较好的效果[4-7]。通过一些鼠和犬的实验证实京尼平的细胞毒性极低，而且应用京尼平所固定的产品具有良好的组织相容性，京尼平是一种与GTA交联效果相当的交联剂，而且其细胞毒性远远低于GTA。Sundararaghavan等[8]应用京尼平来改性胶原蛋白凝胶，并且对不同浓度的京尼平对细胞的影响做了研究，发现经过京尼平改性后，其机械性能明显提高，但京尼平的凝聚物应小于5 m M，否则，将会对细胞产生毒副作用。Ko等[9]利用京尼平交联胶原-硫酸软骨
素-透明质酸，结果表明未经过交联的胶原支架的解链温度是(46.5±1.09)℃，而经过交联的胶原支架解链温度提高到了(78.6±1.26)℃，并且还发现用京尼平进行交联的支架有良好的生物相容性和再现性，未发现细胞不良反应。用京尼平交联所构建的胶原蛋白支架可以为软骨细胞的生长提供了一个良好的环境。
1.4 碳化二亚胺 目前1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺较为常用，碳化二亚胺的交联产物具有很低的免疫原性，且未发现有细胞毒性，因此，它的生物兼容性很好，并且可以产生较好的交联效果。许多实验常将碳化二亚胺与NHS联合使用，并且取得了较好的交联效果。Ma等[10]关于加强胶原蛋白多孔支架稳定性的研究中，应用EDAC/NHS进行交联，结果显示用EDAC/NHS可以形成多孔支架，并且具有较好的细胞相容性，其作用机制是在胶原蛋白相邻的分子之间形成异构肽键。单独使用EDC，在浓度为20 mM进行交联时，交联效果与强度要好于GTA，EDC在水性环境中反应的中间体快速发生水解，NHS对中间物有稳固作用，并且允许胺类反映，并且再用乙醇作为溶剂的条件下，可减少或限制有活性的EDC诱导剂的水解，从而提高交联效果[11]。有许多实验将2种交联剂联合使用来交联胶原，实验表明交联后的胶原解链温度明显提高，胺类含量降低[12]。Pieper等[13]用 EDC/NHS交联Ⅱ型胶原基质，实验结果表明经过EDC/NHS交联后，解链温度较交联前提
高8℃，抵抗胶原酶水解能力明显增强。Angele等发现EDC/NHS交联后的胶原抗胶原酶水解的能力明显提高，较低的浓度(0.5 mg/m L)就可以引起很大的变化，但是高浓度(30 mg/m L EDC/NHS)反而使支架的抗折强度下降。
1.5 环氧化合物(epoxy compound，EC) 是指分子中含有一个或多个环氧基的一类化合物，包括环氧乙烷、环氧氯丙烷等，目前EC对胶原物质交联作用的研究也较多，并且发现交联效果较好，与GTA的交联效果进行相比，用EC交联后解链温度都有所提高，但EC的交联速度明显慢于GTA。经EC改性的胶原具有较好的生物学和物理学性能，尽管EC完全反应时间较长，交联胶原的变性温度比GTA交联者低。Wang等[14]在应用GTA和EC交联胶原传输特性的研究中发现，应用这2种交联剂交联的胶原膜都会导致茶碱和苯佐卡因扩散系数的降低，其膨胀速度比未交联的胶原膜减少50%。研究还发现应用EC交联后的胶原蛋白钙含量测试结果明显低于GTA交联的结果，但经过优化EC结构(环氧基数量、链结构等)和反应条件(温度、p H、促进剂等)，可获得更好的交联效果[15]，因此，经过优化的EC有望成为一种较为理想的化学交联剂。
1.6 酰基叠氮 二苯基磷酸盐(DPPA)酰基叠氮化合物可用于交联胶原。与GTA交联的胶原相
比，酰基叠氮的交联物不易钙化，未发现有细胞不良反应，交联后的胶原支架解链温度和强度也都明显提高。但是，用酰基叠氮进行交联常常需要进行几天以上的反应和洗涤过程，工艺十分复杂。Marinucci等[16]采用DPPA进行交联胶原膜，并且与未交联的膜和用GTA交联的膜进行对比，结果发现应用DPPA交联的胶原期细胞的扩增速度明显高于未交联和使用GTA进行交联的胶原膜，成纤维细胞在DPPA交联的胶原膜上产生的TGF1明显高于用GTA交联的胶原膜。目前许多研究均表明应用DPPA交联胶原支架有良好的细胞相容性，细胞的扩增速度明显高于未交联的胶原支架，但上述实验结果必须留心观察，因为在体内反应是比较复杂的过程，也许效果没有在体外的好。
1.7 醌类 1，4-二(3，4-羟基苯)-2，3-二甲基丁烷(NDGA)，作为一种可以改性胶原蛋白的交联剂，也具有良好的交联效果，用NDGA交联的胶原比用GTA交联的胶原的张力和弹性系数都有明显的提高，其作用机制是通过将邻苯二酚官能团氧化成醌来进行交联反应，NDGA交联的产物可为成纤维母细胞提供较有利的附着和增殖环境。有研究发现，NDGA交联的胶原支架在体内有很好的稳定性，并且在NDGA交联的多孔支架中应用葡萄糖传感器，发现并未对葡萄糖传感器造成影响。Young等[17]在用胶原蛋白构建支架，并植入传感器来增强生物相容性的研究中，应用NDGA进行交联来提高胶原支架的稳定性，研究发现
NDGA交联可以获得较好的稳固性，当植入大鼠皮下4周后观察，没有发现形态变化，支架浸泡在胶原酶溶液中4周后，溶解后的重量约保留最初的70%，而且还发现用NDGA交联对植入内部的传感器没有损害。Koob等[18-19]应用NDGA交联胶原的研究中，在对材料进行的拉伸试验和弹性系数测试中，发现抗拉力强度明显高于天然的跟腱，并且弹性系数与天然的跟腱相当。
2 结 语
胶原蛋白的理想交联方法应该是在保证所交联的胶原蛋白不变性的同时，还要具备无毒副作用，化学交联方法的交联度明显高于物理交联，但由于存在引入外源有毒试剂，化学反应残留物清除难、变等问题，使其在组织工程应用研究中均存在局限性。如采用GTA、EC、紫外线等方法进行交联时，胶原蛋白会变黄;NDGA处理过的胶原纤维会变棕;应用京尼平交联的胶原蛋白会变蓝等，变的原因是使用的化学交联剂和氨基酸反应所致，并且用化学交联剂交联后的胶原蛋白纤维上会出现脊和沿纵轴的裂隙，造成这一现象的原因是纤维的下层结构和(或)由于交联剂反应所形成，但是这种结构显现出有利于细胞的黏附和成纤维细胞的迁移，胶原纤维表面粗糙的程度取决于化学交联剂的选用，不同交联剂
会形成不同的胶原纤维表面特征。在性能方面，经过交联的胶原纤维解链温度会明显提高，如应用GTA和EC交联的胶原蛋白纤维显示出了最高的热稳定性，原因是它可以交联蛋白中大量的亚单位包括距离较远的亚单位，但GTA具有明显的细胞毒性，EC交联时间太长;碳化二亚胺、NDGA、DPPA、京尼平等有较好的交联效果，并且细胞不良反应很小，是近些年应用相对较多的化学交联剂，但目前很多实验都是在体外进行的，其化学交联剂反应的环境远远没有体内的反应环境复杂，所以在应用到体内时，其交联效果和不良反应等问题是值得关注和研究的。化工学报
因此，在应用化学试剂对胶原蛋白进行交联的应用中，必须根据实验目的来选择不同的化学交联剂，以保证交联后可以提高性能的同时还要达到保持胶原蛋白的生物活性，并且对种子细胞没有毒副作用。有时某单一化学交联剂对胶原改性并不能满足材料的要求，因此，在胶原蛋白的交联中可采用2种或2种以上交联方法结合的办法。另外，相关研究发现乙醛酸中的羰基活性较强，易于与胶原侧链的氨基反应，从而可提高收缩温度，还有通过交联蛋白质分子中起重要作用的二硫键来改性胶原蛋白，以提高其特性。虽然这2种目前在组织工程方面应用较少，但为今后的研究提供了很有价值的思路。随着科学的发展，上述化学交联剂在应用中各问题的克服和解决，定能到更好、更适合的胶原蛋白交联剂应用ipda
于组织工程的研究，制作出与人体组织结构和性能相似的、安全的生物支架材料。
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