CAR-NK的构建策略及在血液系统肿瘤中的研究进展 摘要：目前，已有两种ＣＡＲ－Ｔ产品被美国ＦＤＡ已经批准用于临床。但是，随着ＣＡＲ－Ｔ疗法的迅速发展，新的挑战接踵而至。首先，ＣＡＲ－Ｔ的原材料通常是患者自体Ｔ细胞，但是繁琐的制备工艺、较长的制备周期和高昂的价格导致其无法得到广泛的应用。目前正在研发的同种异基因ＣＡＲ－Ｔ或许会解决这些问题，但仍有出现移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）及异基因Ｔ细胞被宿主免疫系统迅速清除的风险。另外，ＣＡＲ－Ｔ疗法可能出现的细胞因子释放综合征（ＣＲＳ）、神经毒性等副作用也是不容忽视的问题。与Ｔ细胞不同，ＮＫ细胞不需要预先致敏就可产生细胞因子并介导细胞毒性，并且其对恶性细胞的杀伤力不受主要组织相容性复合物（ＭＨＣ）的约束。另一方面，ＮＫ细胞在同种异体环境下不会引起ＧＶＨＤ，这使得它作为现成的细胞经过ＣＡＲ修饰后行免疫是安全的。而且，ＮＫ细胞的寿命相对有限，从而降低了经过基因修饰的免疫细胞长期存在于人体可能导致的风险。鉴于ＮＫ细胞具有多种独特优势，研究人员正在探索使用ＣＡＲ－ＮＫ来难治性的恶性肿瘤。槽楔
关键词：CAR-NK；血液系统；肿瘤
引言
偏心井口近年来，癌症免疫已成为一种越来越有前景的方式。过继性细胞免疫通过体外激活和扩增的效应细胞转移至受体细胞以清除肿瘤细胞。随着免疫生物学、合成生物学和生物工程的最新进展，免疫细胞的基因操纵已成为设计有效癌症免疫的创新解决方案。尤其是，过继转移嵌合抗原受体(CAR)工程化T细胞在复发和难治性B细胞淋巴瘤和白血病患者中显示出令人印象深刻的效果，在血液系统恶性肿瘤中前景广阔。自然杀伤(NK)细胞能够靶向肿瘤，无需抗原预敏或人类白细胞抗原(HLA)匹配，是肿瘤免疫的潜在效应器。本文简要概述了用于癌症免疫的CAR-NK细胞的递送技术，重点对基因递送载体的种类和转导效率进行分析，并强调了未来需要解决的潜在问题。
1ＣＡＲ－ＮＫ的结构
细胞外抗原识别域由单链可变片段（ｓｃＦｖ）构成，该片段由抗体的可变重链和轻链组成，并通过短肽连接体融合而成。ｓｃＦｖ赋予了ＣＡＲ－ＮＫ特异性识别并结合靶抗原的能力，并且以不依赖ＭＨＣ的方式靶向抗原。目前为止，已设计出多种ｓｃＦｖ可识别抗原，如ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＮＫＧ２Ｄ配体、ＨＥＲ２、ＧＤ２等。最近，仅由重链
构成的ＣＤ３８纳米抗体被用于生产ＣＡＲ－ＮＫ，这些来自美洲驼的天然单个免疫球蛋白可变域不仅具有与ｓｃＦｖ相媲美的特异性，而且体积小，有助于转导。在ＣＤ３８阳性的多发性骨髓瘤（ＭＭ）细胞上测试了这种新颖ＣＡＲ的细胞毒性，结果证明了其在体外的功效。然而，它们在ＣＡＲ－ＮＫ生产中的应用目前仍处于试验阶段。铰链区是连接ｓｃＦｖ和跨膜结构域之间的区域，通常来源于ＣＤ８α或ＣＤ２８。铰链提升了接触目标抗原的敏捷性，调节铰链的长度可以使工程细胞与靶细胞之间保持最佳间距，当使用长度不理想的铰链可能会导致脱靶效应。跨膜结构域由疏水性α螺旋组成，并将ＣＡＲ锚固在工程细胞膜上。目前已设计多种跨膜被用于构建ＣＡＲ，主要来源于ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８和ＣＤ２８。跨膜结构域是ＣＡＲ结构最不具特征的区域，一般认为其对ＣＡＲ－ＮＫ的整体结构和功能没有太大的影响。但一些证据显示，跨膜结构域的选择可通过细胞激活程度来影响ＣＡＲ结构的功能。
黄山学院学报2ＣＡＲ－ＮＫ的研究报道和现状
肿瘤相关抗原（ＴＡＡｓ）表达的减弱或ＭＨＣ⁃Ｉ的下调被认为是肿瘤细胞逃避免疫监视的其他机制。ＣＡＲ是一种合成的混合抗原受体，通常由抗体的可变区域和Ｔ细胞受体（
禅修学院ＴＣＲ）的恒定区域组成，使免疫细胞能够选择性识别肿瘤细胞上表达的ＴＡＡｓ。尽管通用性ＣＡＲ⁃Ｔ细胞的研发如火如荼，但目前的ＣＡＲ⁃Ｔ疗法需要采集患者自身Ｔ细胞（有ＭＨＣ限制性），制备周期长，且受限于重症和淋巴细胞减少的癌症患者中获得足量的自体Ｔ细胞。作为ＣＡＲ⁃Ｔ细胞的替代方案，ＣＡＲ－ＮＫ细胞不仅规避了这些挑战，而且ＣＡＲ－ＮＫ细胞不仅可通过ＣＡＲ特异性识别表达抗原的肿瘤，还可通过ＮＫ细胞受体本身杀伤肿瘤。此外，扩增细胞可以使用同种异体ＮＫ细胞来源，而无需担心移植性抗宿主病（ＧｖＨＤ）。不仅如此，ＮＫ细胞系或多功能干细胞（ｉＰＳＣｓ）分化的ＣＡＲ－ＮＫ细胞，潜力也备受瞩目。用含有ＣＡＲ结构的逆转录病毒或慢病毒的表达载体，转染原代ＮＫ细胞或ＮＫ细胞系（常用ＮＫ⁃９２）。研究表明，将ＩＬ⁃１５、ＩＬ⁃２１和自杀基因引入ＣＡＲ－ＮＫ可增强其安全性和有效性。ＣＡＲ－ＮＫ细胞的基础研究仍处于起步阶段，提高其的安全性和有效性仍是临床应用的挑战，包括抑制免疫检查点和靶向ＴＭＥ的联合可能为基于ＣＡＲ－ＮＫ细胞的免疫提供一个新的方向。
3讨论
十六届三中全会>魁蒿ＭＳＬＮ作为一种膜表面蛋白，在血液系统肿瘤中特异性高表达，因此可以成为血液系统肿瘤免疫的理想靶点。本研究以间皮素为靶点，使用慢病毒转染的方法构建了ＣＡＲ－ＮＫ⁃９２细胞，具有较强的抗肿瘤作用。其中，ＣＡＲ结构中包含的ＣＤ１３７和ＣＤ３ζ作为ＮＫ细胞上的重要分子，对激活ＮＫ细胞起着重要的作用；同时高效率的转染提高了ＣＡＲ－ＮＫ⁃９２细胞的纯度，也进一步提高了ＣＡＲ－ＮＫ⁃９２细胞的杀伤作用。此外，在本研究中，ＣＡＲ介导的杀伤作用伴随着更高水平的ＩＦＮ⁃γ和ＴＮＦ⁃α的分泌，也进一步证实了ＣＡＲ能够介导更强大的杀伤作用。ＮＫ细胞是一先天毒性淋巴细胞，与Ｔ细胞相比具有较低的免疫原性。因此ＣＡＲＮＫ被认为更有希望应用于肿瘤的临床。当前ＣＡＲＮＫ研究中较常使用的ＮＫ细胞有外周血源ＮＫ细胞、脐带血源ＮＫ细胞和ＮＫ细胞系。本研究选用ＮＫ⁃９２细胞系作为研究对象，因为ＮＫ⁃９２细胞在体外ＩＬ⁃２刺激下，能够大量扩增，并且在表型特征上不会发生较大的改变；与此同时，ＮＫ⁃９２细胞容易受慢病毒转染，可以得到高纯度的ＣＡＲ－ＮＫ⁃９２细胞。因此，ＣＡＲ－ＮＫ⁃９２细胞在肿瘤领域具有良好的应用前景。当前已经有很多国家正在积极开展ＣＡＲ－ＮＫ⁃９２研究，并且已经取得不错的效果。但是ＮＫ⁃９２细胞来源特殊，在体内不能持续增殖，因而发挥的抗肿瘤作用有限。
结束语
目前，临床前及临床试验研究表明，ＣＡＲ－ＮＫ免疫疗法可能发挥着重要的抗肿瘤作用，并且在安全性、“现成”生产的可行性以及对实体瘤的疗效较ＣＡＲ－Ｔ更具有优势。目前，ＣＡＲ－ＮＫ的临床前研究和临床试验结果支持其运用到癌症中。相信在不久的将来，随着临床前试验及临床研究的广泛进行，ＣＡＲ－ＮＫ免疫疗法能为肿瘤提供一种安全、经济、现成的产品，成为抵抗恶性肿瘤的有力武器。
参考文献
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