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周智广 何 凌
(中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所，湖南长沙410011)
作者简介：周智广(1961 )，内科学教授，博士生导师。中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所副所长，湖南省医学会内分泌分会副主任委员，中华医学会内分泌分会委员。研究方向为自身免疫糖尿病和糖尿病血管并发症。主持国家、省部级及国际合作课题21项，发表论文145篇，获国家、部省级科技进步奖6项，享受政府特殊津贴。
摘要：自身免疫糖尿病是一种T 细胞介导的胰岛 细胞选择性破坏的自身免疫病。主要组织相容性复合物(ma jor histocompability complex,MHC)限制性中枢及外周T 细胞自身耐受丧失，细胞免疫调节失衡，胰岛自身抗原反应性T 细胞克隆活化,Th1细胞及其细胞因子释放占优势，将启动、维持和加速自身免疫性胰岛炎，导致糖尿病发生。应用ELISPOT 和可溶性MHC-肽四聚体技术并解决T 细胞分析的标准化问题，将显著促进自身免疫糖尿病与细胞免疫学研究的发展。 关键词：糖尿病; 自身免疫; T 细胞; ELISPOT ; Tetramer
恶棍来访中图分类号:R587.1 文献标识码:A 文章编号:1001 1773(2003)01 0001 04
糖尿病患病率呈全球性迅速增加，其确切发病机制至今不明。1型糖尿病中的自身免疫亚型，属于器官特异性自身免疫性疾病的观点已得到共识，发病过程中细胞免疫与体液免疫均有参与，前者的作用更为显著[1]。本文就自身免疫糖尿病细胞免疫学研究进展作一综述。
1 B 细胞与T 细胞 孰轻孰重?
20世纪70年代中期到90年代中期，有关研究多集中在血清中自身抗体的检测并由此发现了若干种至关重要的自身抗原，曾认为B 细胞介导的体液免疫在1型糖尿病(T1D M )的发病过程中起决定性作用，但随着研究的深入，这一观点已日益受到挑战。目前仍无证据表明自身抗体在T1DM 发病中的直接作用。在一组动物实验中，将一例胰岛细胞抗体(ICAs)及谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)阳性患者外周血单个核细胞(PB MCs)转移给严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠，并通过转移人类B 淋巴细胞使小鼠产生I CAs，但其并未发生胰岛细胞损害、糖耐量异常或糖尿病。这说明糖尿病相关自身抗体本身并不足以诱导 细胞破坏，而只是针对 细胞自身免疫反应的标志物而已，而且出现的时间晚于自身免疫性T 细胞。有关NOD 鼠和BB 鼠的动物试验
也提供了大量证据表明T1D M 胰岛 细胞损伤是由T 细胞而非B 细胞所介导。如将从糖尿病动物脾或炎症胰岛所得的CD4+T 细胞克隆转移给NOD 或NOD SCID 小鼠，足以使后者发病。因此，自90年代中
期，研究者们将更多注意力转移到细胞介导的自身免疫，尤其是T 细胞在其中所起的作用。研究发现
[2]
: 将T1D M 患
者骨髓移植给HLA 相容的同胞，可使后者发病; T1DM 患者接受其非DM 双生子或HLA 相同的同胞胰岛移植后可使DM 复发; 在新发T1DM 患者中，予主要针对T 细胞的免疫抑制剂(如环孢霉素A)可以阻止 细胞功能下降; 大量淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞浸润胰岛导致胰岛炎; 将初生期NOD 鼠胸腺切除可以阻止 细胞破坏；针对表达CD3,CD4,CD8表面标志的抗体也可达到同样效果; 将DM 鼠T 淋巴细胞转移给非D M 鼠，可导致后者发生胰岛炎和糖尿病。现阶段，人们普遍倾向于T1DM 是一种T 细胞介导，导致分泌胰岛素的胰岛 细胞特异性损伤的自身免疫性疾病。
T 细胞是通过何种机制直接或间接地破坏胰岛 细胞呢?目前认为,T 细胞的作用由一系列复杂精密的机制所调控，例如T 细胞在胸腺内的成熟，抗原的部位
1
收稿日期:2003 01 02
国家自然科学基金:30170440 教育部跨世纪优秀人才基金项目
第23卷第1期2003年2月
国外医学 生理、病理科学与临床分册
Foreign M edical Sci ences Sec tion of Pathophysi ology and Clinical M edici ne
Vol.23 No.1
Feb. 2003
和性质，抗原表达的水平和时机等，特定等位基因的遗传性状以及T细胞暴露于病原可以使这些自身反应T 细胞失控而破坏自身组织成分。当T细胞在胸腺内经历阳性选择和阴性选择过程后，在外周发挥作用的应该是自身MHC限制并且自身耐受的，当这种耐受性丧失后,T细胞便会攻击自身胰岛 细胞而导致糖尿病发生。
2 免疫调节细胞的作用
在深入研究T细胞的致病机制时，发现许多证据支持T1DM是一种因免疫调节机制紊乱所导致的自身免疫性疾病。大致说来，免疫效应细胞在体内受到一系列复杂精密的调控与制约，有的使免疫效应增强，有的使其减弱。众所周知，辅助性T细胞根据其所分泌的细胞因子可以分为Th1及Th2细胞，前者
分泌I L 2, I FN ,TNF 等，主要介导细胞免疫，而Th2细胞分泌I L 4、IL 10等，主要介导体液免疫。这两种细胞通过其所分泌的细胞因子相互制约，处于动态平衡状态。当一定的 细胞自身抗原被巨噬细胞或其他抗原递呈细胞处理后，与MHC II类分子一起递呈到抗原递呈细胞表面，引起自身免疫信号的释放，从而激活Th1细胞，抑制Th2细胞及其细胞因子释放，使Th细胞以Th1细胞表型占优势，激活细胞毒性巨噬细胞，细胞毒性T细胞(CD8+TC)和自然杀伤细胞(NK)，导致胰岛 细胞破坏。但目前各实验室对各种细胞因子在T1DM发病过程中作用的研究结果并不一致，很难划分某种细胞因子究竟起保护抑或损伤作用。这可能与实验条件、培养细胞品系及体内外环境差异等诸多因素有关。在自身免疫糖尿病方面，人们更多观察到的是免疫抑制细胞功能不足，导致免疫效应细胞过度活化而引发自身免疫性疾病。
近年发现，自然杀伤T细胞(NKT细胞)在诱导和维持外周耐受方面起到了至关重要的作用。NKT细胞并非NK细胞，它是经典T细胞的一个亚，并具有在活化后可以迅速产生细胞因子如IL 4及I FN 的显著特征。但是它又有别于胸腺来源的其他淋巴细胞，因为它们表达NK细胞特征性的表面标志，如类似于T细胞抗原受体(TCR)恒定区的类型。刺激TCR后,NKT细胞分泌大量IL 4。其产生IL 4并不依赖于IL 4的存在，甚至在有I L 4抗体存在的情况下也可以产生，这一点又不同于经典的CD4+T细胞。尽管如此,NK T细胞的反应依然依赖于外界细胞因子的作用，比如I L 7可以增加NKT细胞I L 4的产量，而IL 12则可以增加其I FN 的产生。这细胞同样可以表达表面受体及溶细胞活性。在T1DM动物模型NOD鼠已经发现其存在省委书记秘书
NKT细胞功能不足。NKT细胞在数量及功能上均存在缺陷，而将野生型的NKT细胞或V 14+J 281+转基因脾脏NK T细胞过继转移给前糖尿病鼠时，则可以阻止其发病。有作者认为,NKT细胞直接调节Th2细胞介导的免疫反应，间接调节Th1细胞介导的自身免疫。
然而，要真正了解NKT细胞的特性，必须先要清楚一种几近公认的免疫调节细胞，即CD25+T细胞[3,4]。
CD25+T细胞是NKT细胞中的一种，其表面标志为CD4+CD25+，具有逃避自身免疫的免疫调节功能，可以调节CD8+T细胞的活化，在免疫介导的糖尿病患者此类细胞减少[5]。粒 巨噬细胞集落刺激因子及I L 4处理过的树突状细胞可以成功预防NOD鼠发生糖尿病，在进行机制探讨时，发现其脾脏中的CD4+CD25+细胞分泌大量的Th2型细胞因子，从而纠正NOD鼠的免疫调节缺陷，抑制Th1细胞的致病作用[6]。然而，对于此类细胞的作用，也有学者持不同看法,Reijonen等发现，在T1DM及部分危险人中，可以检出CD4+CD25+细胞，但是在正常对照组却不存在这类细胞[7]。因此，这类细胞究竟在自身免疫糖尿病发生过程中起破坏抑制或保护作用，有待进一步研究。
3 细胞免疫与体液免疫的关系
自身免疫糖尿病的发病有众多针对自身抗原的T 细胞的参与，且T1DM患者发病前及新发病者体内有多种胰岛自身抗体，那么两者之间的关系怎样?能否以一者的强弱来预测另一者的程度?学者们对此进
行了探讨，得到的结果不尽一致。Hawke s在研究针对蛋白酪氨酸磷酸酶(I A 2)的免疫反应时，发现抗体水平与T细胞反应性无相关关系[8]。1998年，法国学者Mayer 在研究T1DM患者T细胞对胰岛素的反应性时发现，胰岛素自身抗体(IAA)滴度与T细胞对胰岛素的增殖反应无关。然而在I A 2抗体(+)者，其T细胞对胰岛素的反应强于IA 2Ab(-)者，其差异有统计学意义。分析自身抗体可以通过独特型-抗独特型反应影响T细胞增殖[9]。同时,ICA,IAA及GADA均为(-)者其T细胞对胰岛素无增殖，说明自身免疫同普通的免疫反应一样，在细胞免疫和体液免疫间存在着一定的协调关系。德国学者Durinovic Bello则发现，在T1D M患者胰岛素抗体(+)的一级亲属中,IAA水平与胰岛素特异性T细胞反应程度呈正相关[10]。1999年，法国学者研究ICA(+)的T1DM一级亲属时，发现其I AA与T细胞对胰岛素的反应呈负相关，而在长程T1D M却无此关系[11]。同样，在第一届T细胞测定标准化国际会议报告中，专家们对该方面问题也进行了总结，认为针对GAD、胰岛素的T细胞增殖与抗体反应无相关性[12]。2
第1期国外医学 生理、病理科学与临床分册 第23卷
各实验室所得结果的差异可能与所采用的自身抗原、T 细胞来源、实验条件及实验方法等诸多因素不同有关。
4 T细胞免疫学检测进展
迄今最常用且最经典的检测T细胞免疫反应的方法为PBMC的增殖反应，以氚标记胸腺嘧啶核苷的掺入
予以反映，评价针对胰岛 细胞抗原的T细胞免疫反应。胰岛素和GAD是最常见的胰岛自身抗原之一。受抗原制剂差异、细胞培养条件等多种因素的影响，细胞增殖反应的检测结果变异很大，加之存在一定的放射污染，使其应用受到限制。而检测PBMC分泌的细胞因子，是探讨T细胞免疫反应的另一途径。Th1细胞介导的炎症性免疫反应所产生的 干扰素(IFN )对胰岛 细胞有显著性破坏作用。新近出现的固相酶联免疫斑点(enzy me linked immunospot,ELISPO T)试验，是在以往ELISA检测基础上的进一步发展。它以双抗体夹心法检测胰岛特异性自身抗原G AD或胰岛素刺激T 细胞分泌的细胞因子IF N 等，以生物素-链亲合素系统偶联酶放大斑点检测信号，并以电子扫描系统记录分析检测结果，可以检测出外周血中极少量的、甚至是早期反应的抗原特异性T细胞，以及利用其所形成的克隆在单细胞水平上分析其分泌的细胞因子，从而了解其功能。该方法敏感性较传统的ELISA法高400倍，分析客观，易于操作，是一种理想的细胞免疫反应的评估方法[13,14]。
另一种颇为引人注目的方法是利用可溶性MHC 肽四聚体(soluble MHC peptide tetra me r，简称Tetra mer)来分析T细胞的反应性。该方法敏感性更高，可以直接检测并定量T细胞与特异性抗原的亲和力大小，还能通过流式细胞仪将抗原特异性T细胞分离出来，保存或作进一步培养，有助于进一步分析其特性。自从1996年Altman等创立了该方法以来,Tetra mer技术在多方面得到了广泛的应用。当初他们利用该方法检测可识别HI V抗原肽的特异性T细胞，通过基因工程技术把15个氨基酸的Bir A底物肽(BSP)加在人白细胞抗原HL A 2重链的羧基端形成融合蛋白，在体外按一定的比例与B2微球蛋白及特
异的抗原短肽共孵育，使其折叠成正确的构象，成为MHC 肽复合物，再经过纯化，把生物素标记在底物肽的赖氨酸残基上，使一个标记荧光素的链亲和素与4个生物素标记的MHC 肽复合物结合形成四聚体。MHC 肽四聚体与抗原特异性T细胞上的TCR结合后，即可以通过灵敏度很高的流式细胞仪进行检测。现在,Tetra mer技术在T细胞活化、凋亡以及监测等研究方面发挥了重要作用[15,16]。
5 T细胞分析的标准化
正如前文所述，针对同一个胰岛自身抗原，不同实验室培养的T细胞对抗原的反应性可能并不一致，有些甚至得出了相反的结果，这样就使得彼此的结果缺乏可比性和重复性。针对这一现象,1999年和2001年分别召开了有关T细胞测定标准化的国际会议。各国专家分析了造成这一现象的原因并制定了一些解决方案[12,17]。
5.1 T细胞测定缺乏标准化的原因 重组自身抗
原是研究T细胞反应的关键，然而大多数供研究用的自身抗原的质量不够标准; 目前很难判定出一个 金标准 ，以判断达到什么程度才能算T细胞对自身抗原有阳性反应; 无论是D M组，还是非D M对照组，不同研究者所面对的实验对象存在很大差异。值得注意的是，尽管人们已普遍认同HLA在T细胞识别抗原及增殖方面作用甚大，但几乎一半的实验对象并未实现HLA分型及匹配; 还有一点并不很好解释，即从整体看来,T细胞对自身抗原的反应没有对非自身抗原活跃，而且较后者难于测定。
事件监控5.2 可能的解决方案 以混合的对照抗原作为
阳性标准; 加小量IL 2防止细胞凋亡; 增加刺激抗原刺激细胞的孔数，而不限于3孔; 对对照组应有统一定义; 评估剂量反应范围; 确立可达成一致的分析方法; 尚可采用一些新技术如ELISPOT分析细胞因子，有限稀释法及Tetra mer技术。
经过上述努力，在第二届国际T细胞测定标准化会议上，通过对三种自身抗原(GAD65,IA 2，胰岛素原)及其T细胞反应的分析，发现实验结果较首次会议所得有所提高，尤其是自身抗原的制备较前稳定。相信通过进一步工作,T细胞反应的分析将会更加标准化，从而为自身免疫糖尿病细胞免疫学的研究和应用提供有力的工具，并促进细胞免疫学研究领域的蓬勃发展。
参 考 文 献
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