NK细胞是一类重要的固有免疫细胞,在机体抗肿瘤、抗病毒中发挥重要作用。NK细胞最重要的生物学作用是杀伤靶细胞,其主要机制之一是：NK细胞与靶细胞接触而形成免疫突触,NK细胞脱颗粒并释放效应分子,其中穿孔素可在靶细胞表面形成微孔道,颗粒酶循该孔道进入靶细胞内而诱导凋亡。 靶细胞内,颗粒酶诱导凋亡相关的caspase级联反应,通过直接作用pro-caspase切掉天冬氨酸残基激活下游caspase而发挥作用。免疫突触内部分胞毒效应分子未进入靶细胞,其转归及功能尚不清楚,待阐明的问题之一是：滞留免疫突触内的穿孔素和颗粒酶是否会伤害NK细胞本身；其代谢与去向如何；等等。
疾病监测
文献已报道,细胞毒性细胞可通过独特机制处理胞内错位的颗粒酶B (GzmB)和穿孔素(PFN)。例如,NK细胞内表达GzmB特异性抑制剂—丝氨酸蛋白酶抑制剂9(PI-9),后者可及时灭活胞内渗漏的GzmB。鉴于NK细胞具有连续杀伤靶细胞的功能,我们提出如下推测：释放并滞留于免疫突触的效应
分子可能被回收而重新利用。本课题以非何杰金淋巴瘤来源的NK92细胞系为模型,在靶细胞刺激下,探讨NK92细胞所释放GzmB的转归。 一、NK92细胞在靶细胞刺激下出现继发性胞吞现象1.应用苯乙烯染料FM1-43观察NK92细胞继发性胞吞现象苯乙烯染料FM1-43可与细胞膜磷脂双分子层可逆性结合,发出荧光,而其在溶液中则几乎检测不到荧光。细胞发生内吞后,苯乙烯染料内吞入细胞内,细胞膜上荧光可用磷酸盐缓冲液洗掉。
借此原理,本实验首先将NK92细胞用FM1-43预染,然后用猪内皮细胞(PEC)刺激1h,激光共聚焦显微镜(LCM)观察NK92细胞内吞情况。结果显示,未用PEC刺激的NK92细胞膜上显示荧光,PEC刺激的NK92细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞膜后,细胞内显示荧光,提示NK92细胞在胞吐后细胞膜发生内化。
2.靶细胞刺激的细胞膜内吞过程依赖于clathrin细胞膜的内吞常见形式为依赖于clathrin的经典途径,也可依赖于巨胞饮(macropinocytosis)、小窝蛋白(caveola)和脂筏(lipid raft)等途径。我们采用clathrin特异性抑制剂CPZ预处理NK92细胞,再用FM1-43标记细胞膜,使用靶细胞刺激后激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光。
实验结果显示,CPZ处理后NK92细胞胞内荧光强度显著降低,提示NK92细胞膜内吞依赖于clathrin内吞途径。同时用流式细胞术检测细胞内荧光强度,结果显示使用CPZ后细胞内荧光强度约为对照组的48%。
我们将NK92细胞用FM1-43标记,分为两组,分别用PEC在4℃和37℃刺激1h,结果显示：在4℃细胞并不发生内吞,提示NK92细胞内吞作用与温度相关,是一种主动内吞。二、靶细胞刺激下,NK92细胞继发性胞吞伴随GzmB回收1.NK92细胞内吞的GzmB进入早期内体NK92细胞膜内吞过程为经典的clathrin依赖途径,CPZ预处理的NK92细胞经靶细胞(PEC)刺激,收集未刺激组、刺激后15min、30min的细胞,免疫荧光检测GzmB和早期内体EEA-1在胞内共定位情况,结果显示：未刺激组EEA-1与GzmB均有表达,二者未出现共定位；靶细胞刺激15min后,GzmB含量明显增多,GzmB与EEA-1有明显共定位,用CPZ处理后共定位显著减少。
靶细胞刺激30min后,GzmB与EEA-1共定位比15min组减少。提示NK92细胞继发性胞吞伴随GzmB回收。
为进一步验证上述结果,本实验设计针对clathrin蛋白重链的siRNA,采用核转染方法瞬时转
染NK92细胞。转染后的细胞用靶细胞刺激,免疫荧光法在15min检测GzmB和EEA-1共定位情况,结果显示干扰组EEA-1与GzmB共定位比对照组明显降低。
2.NK92细胞内吞的GzmB可进入溶酶体Clathrin依赖的内吞途径包括从早期内体→晚期内体→溶酶体的全过程。免疫荧光检测靶细胞刺激60min后的NK92细胞GzmB与lamp1共定位情况。
文献研究法结果显示,与未刺激组相比,GzmB与lamp1出现明显共定位；使用CPZ或siRNA后,共定位明显减少。GzmB与lamp1共定位提示GzmB进入溶酶体,且进入后并未被降解。
为此,使用溶酶体酶抑制剂leupeptin处理NK92细胞,免疫荧光检测GzmB和lamp1共定位,结果显示共定位并未增加,提示GzmB在溶酶体内未被降解,可供分选重复利用。三、抑制NK92细胞内吞能显著降低杀伤靶细胞活性采用K562作为NK92细胞的靶细胞,CFSE-PI法在不同的效靶比(2.5：1,5：1,10：1)下流式细胞术检测其杀伤率。气体保护焊丝
结果显示：相对于对照组,不同效靶比下CPZ预处理过的NK92细胞杀伤活性明显下降(16.93% vs 1.45%,20.44%vs 1.69%,30.22% vs 2.79%)。当采用siRNA干扰clathrin后,重
复以上细胞毒性实验,得到相似的结果,相比于对照组,不同效靶比下干扰组的杀伤活性明显下降(23.18% vs 10.63%,25.31%vs 13.02%,38.69% vs 15.51%)。
四、NK92细胞杀伤靶细胞后上清及胞内GzmB含量检测为检测CPZ对NK92细胞胞吐后上清和细胞内颗粒酶B含量的影响,本实验在10：1效靶比条件下,NK92细胞与K562作用1h、3h、5h,ELISA检测上清GzmB含量,Western-blot检测胞内GzmB含量。结果显示,随杀伤时间延长,对照组和CPZ处理组上清GzmB含量逐渐上升,与对照组相比,1h和5h组CPZ处理组上清GzmB含量略有上升(1.8ng/ml vs 2.0ng/ml,2.45ng/ml vs 2.8 ng/ml),3h组GzmB含量有所下降(2.7ng/ml vs 2.25ng/ml)。
相应各个时间点Western-blot检测胞内GzmB,杀伤后1h、3h、5h, CPZ预处理的NK92细胞内GzmB含量与对照组相比下降。五、结论1.靶细胞刺激NK92细胞,胞吐后发生继发性内吞,且这种内吞依赖于clathrin。
2.NK92细胞继发性胞吞伴随效应分子GzmB回收。3. GzmB被NK92细胞回收,依此进入早期内体→晚期内体→lamp1+溶酶体→分泌型溶酶体,供再利用。
4.抑制NK细胞内吞可显著降低NK细胞杀伤活性。多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)是以神经脱髓鞘为主要病理改变的中枢神经系统(CNS)炎症性疾病。
东风11
用于研究MS的经典动物模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)。此模型通过主动免疫神经髓鞘来源的抗原或过继转移髓鞘特异性T细胞,在实验动物中枢神经系统诱导炎症,其脱髓鞘和炎性细胞浸润等病理表现及疾病表现类似于人MS,故被广泛应用于MS发生、发展、转归、调控等细胞和分子机制研究。
IL-33是近年新发现的IL-1家族成员,其基因序列和结构与IL-1家族成员IL-18和IL-1β相似。IL-33受体是孤儿受体ST2,也称为IL-1 RL1。
ST2基因主要编码两种形式ST2蛋白：膜结合型ST2和可溶性ST2。IL-33表达于人和小鼠多种组织,主要是上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞。 IL-33具有重要免疫调节作用,并参与多种免疫相关疾病(如哮喘、类风湿关节炎、内毒性休克等)发生。IL-33主要介导Th2细胞应答,诱导Th2型细胞因子产生。
有文献报道,中枢神经系统高表达IL-33。本课题主要观察正常小鼠和EAE小鼠中枢神经系统
内IL-33的表达、来源及其参与EAE发病的作用及机制。中国电线电缆协会
一、IL-33在小鼠中枢神经系统的表达1.IL-33在正常小鼠中枢神经系统表达逆转录PCR、实时定量PCR、Western-blot检测正常C57BL/6小鼠脊髓、脑、皮肤、肺、肾脏、心脏、脾脏和肝脏组织IL-33表达；免疫荧光、免疫组织化学检测小鼠脊髓中IL-33表达。结果发现,在mRNA和蛋白水平,正常小鼠脑和脊髓IL-33表达水平远高于肝脏、脾脏等组织(约为12.5倍,P<0.01)。
免疫荧光显示,正常小鼠脊髓高表达IL-33,主要定位于灰质,表达在细胞核内。免疫组织化学同样证明IL-33表达于细胞核内。
Western-blot证明细胞核和细胞浆内均表达IL-33。2.脊髓中IL-33的细胞来源借助冰冻切片免疫荧光检测IL-33在正常小鼠脊髓的细胞定位,通过研究IL-33与星形胶质细胞标志物、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、小胶质细胞标志物(CD68)、神经元特异性蛋白(NeuN)的组织共定位情况,确定IL-33在正常小鼠中的来源。
结果显示,IL-33在体内与3种细胞标志物均未出现明显共定位,故暂时不能确定IL-33的细胞
来源。3.EAE小鼠脊髓内IL-33表达PCR、Western-blot和免疫组织化学检测正常小鼠和EAE小鼠脊髓IL-33表达,分别提取正常小鼠和EAE模型小鼠脊髓胞核、胞浆蛋白,Western-blot检测IL-33表达改变。
结果显示,与正常小鼠相比,在mRNA和蛋白水平上,EAE动物体内IL-33表达量降低；免疫组织化学显示正常小鼠IL-33表达于细胞核内,而EAE动物IL-33表达于胞浆,提示EAE动物体内IL-33发生从胞核向胞浆的转位；western-blot结果显示,正常小鼠IL-33表达于胞浆和胞核,EAE小鼠胞核不表达IL-33,胞浆中有表达。4.IL-33受体ST2在正常小鼠和EAE小鼠脊髓中表达免疫组化显示,正常小鼠ST2表达水平低,EAE小鼠ST2表达水平明显增高水平。
二、IL-33参与小鼠EAE发生及其机制1.IL-33对小鼠EAE疾病进程的影响EAE小鼠于免疫前腹腔注射rIL-33(1μg/只)或发病后注射rIL-33(每天1μg/只,连续注射1周)。结果显示,注射rIL-33不影响小鼠EAE发病时间和疾病进程。
2.抗IL-33多克隆抗体对EAE疾病的影响EAE小鼠于免疫前腹腔注射抗IL-33抗体(150μg/只)或发病后注射抗IL-33抗体(每隔3天150μg/只,连续注射5次),结果发现：抗IL-33抗体可明显加重EAE疾病症状,EAE发病率升高,临床评分提高；两者发病时间相似；EAE小鼠脊髓冰冻
切片免疫荧光检测显示,CD4+T细胞浸润增加。3.抗IL-33多克隆抗体可增强Th1和Th17细胞应答从注射抗IL-33抗体的EAE小鼠采集并分离脾脏细胞,体外用20μg/mlMOG35-55抗原肽刺激淋巴细胞,72h后ELISA检测上清IFN-γ、IL-17、TNF-α水平,及脊髓组织IFN-γ、IL-17、TNF-αmRNA水平。
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