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金黄葡萄球菌是社区和院内感染的主要病原体,可引发菌血症、腹膜炎、肺炎,甚至脓毒症性休克而死亡。脂磷壁酸LTA(lipoteichoicacid)是金葡菌细胞壁的重要保守结构,对金葡菌的生长分裂,宿主细胞黏附等具有重要作用。东周刊事件
但由于LTA属于是胸腺非依赖抗原,不易诱导免疫应答及免疫记忆,因此不适于作为疫苗候选。研究表明利用噬菌体展示技术可获得模拟多糖的表位序列。 在前期工作中我们利用该技术得到多个模拟LTA表位的序列,根据其中一个阳性序列合成四分枝多价抗原肽(命名为MAP2-3)。MAP2-3免疫后可保护小鼠抵御金葡菌系统性感染,包括在脓毒症休克模型中提高小鼠生存率以及在菌血症模型中降低脏器中细菌载量。
正定方言本部分工作进一步探讨MAP2-3免疫诱导保护作用的机制。主要包含以下内容:第一部分LTA模拟肽的合成及其抗血清特异性的鉴定1.根据前期筛选所得阳性克隆序列,通过在线软件预测序列理化特性,分析表明阳性序列GHKEDRQWCQHS的亲水性、可及性均高于另外两条序列;根据该序列合成四份支多价抗原肽(称为MAP2-3)。
ELISA结果表明,MAP2-3能与两种不同的抗LTA单抗结合;2.以MAP2-3或MAP支架(MAPctrl)加弗氏佐剂(按体积比1:1)乳化,免疫BALB/c鼠(100μg/只,皮下注射),两次免疫间隔2周,共4次。第三组小鼠为空白对照组;3.以MAP2-3免疫小鼠。
末次免疫后7天采血、收集血清。ELISA结果显示,与MAPctrl组和空白对照组相比,抗MAP2-3血清能特异地与MAP2-3、LTA以及金葡菌超声裂解产物结合。
4.末次免疫后7天采血、收集血清。ELISA检测MAP2-3免疫诱导体内产生抗LTA的IgG类抗体。
第二部分抗LTA模拟肽抗血清的调理吞噬功能及被动免疫保护作用1.以MAP2-3免疫新西兰兔。末次免疫后7天采血、收集血清。太极美女马畅
ELISA结果显示,与未免疫血清(NRS)相比,兔抗MAP2-3血清能特异地与MAP2-3、LTA以及金葡菌超声裂解产物结合。2.调理吞噬实验结果表明,在补体存在下,鼠抗MAP2-3抗血清能增强小鼠中性粒细胞杀伤S.aureus。
在补体存在或补体灭活情况下,兔抗MAP2-3抗血清能增强小鼠中性粒细胞杀伤S.aureus。3.
在菌血症模型中,过继转移抗MAP2-3抗血清显著降低小鼠血液、肺脏及肾脏中的细菌残存量;4.在肺炎模型中,过继转移兔抗MAP2-3抗血清显著降低小鼠肺内细菌载量,同时减轻肺内炎性细胞浸润;5.在皮肤脓肿和坏死模型中,过继转移兔抗MAP2-3抗血清显著减小皮肤坏死面积以及降低脓肿部位细菌载量。
第三部分LTA模拟肽诱导特异性免疫应答和免疫记忆的探讨以MAP2-3免疫BALB/c鼠。末次免疫一个月后腹腔注射热灭活金葡菌。
7天后无菌取小鼠脾脏、淋巴结、股骨和胫骨,获得单细胞悬液。1.ELISPOT结果显示在MAP2-3小鼠脾细胞中,特异性识别LTA、可分泌IgG的抗体分泌细胞(antibody-secreted cells,ASCs)以及特异性针对S.aureus、分泌IgG的ASCs数量显著高于MAPctrl对照组和空白对照组;2.流式细胞术结果显示,与MAPctrl组和空白对照组相比,MAP2-3免疫组小鼠:(1)脾脏和骨髓中浆细胞(B220-CD138+)表达量明显增高;(2)脾脏中GC-B细胞(CD19+CD95+GL7+)表达百分比明显增高;(3)脾脏中滤泡辅助性T细胞(TFH,CD4+CXCR5+PD-1+)表达百分比明显增高;(4)脾脏和骨髓中记忆性B细胞(B220+CD38+IgD-GL7-IgG+)百分比明显增多;(5)脾脏中记忆性B细胞表面CD80表达量明
显增高;(6)脾脏和淋巴结中效应型记忆性T细胞(TEM,CD4+CD44+CD62L-)百分比明显增高。
水工系
实达网络3.以LTA及热灭活S.aureus体外刺激脾细胞24 h,ELISA结果显示LTA刺激MAP2-3免疫组脾细胞分泌IL-6,灭活S.aureus刺激MAP2-3免疫组脾细胞分泌IL-2、IFN-γ和IL-6。结论:模拟LTA的四分支多价抗原肽(MAP2-3)能够有效诱导特异性体液免疫应答和免疫记忆,保护BALB/c小鼠抵御S.aureus感染。
这一工作为S.aureus疫苗研究提供新的策略。
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