扌直逖碌妇 2021, 47(2):150 - 155Plant Protection
摘要虫生真菌的毒力退化是一种普遍现象，表现为产抱能力下降或丧失、毒力下降及次级代谢产物合成能力下降 等。基于玫烟棒束抱Isaria fumosorosea PF904菌株继代培养后产抱量和毒力严重退化，本试验采用添加4种不 同营养物质的培养基对其进行复壮。结果表明：培养基中添加甲壳素粉后菌株毒力恢复最好，复壮第10代时对小 菜蛾幼虫的致死中时（LTs 。）由初始菌株的5. 86 d 下降至3. 32 d，接菌第7天校正死亡率高于82%，且恢复比例较
稳定；蚕蛹培养基复壮后菌株产抱量恢复最好，复壮第10代时，产抱量由初始菌株的4. 28X 106个/cm 2提升至
1. 73X107个/cm 2，提升3倍之多，但毒力恢复较差；而蝉蜕培养基复壮后产抱量和毒力恢复均不稳定；添加3种营养
物质的综合培养基，第10代LT 。和产抱量分别恢复为3. 53 d 和1. 58X107个/cm 2，对两者具有较好的恢复效果。
郭恒
，赵义涛，郑海霞，张仙红*
（山西农业大学农学院，太谷030801）
关键词玫烟棒束抱；中图分类号
：S 476. 12
复壮; 毒力; 产抱量
文献标识码
：A
DOI
： 10. 16688/j. zwbh 2020146
Rejuvenation of Isaria fumosorosea by adding different nutrients in the media
GUO Heng , ZHAO Yitao, ZHENG Haixia , ZHANG Xianhong *(College of Agronomy , Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China')
Abstract Entomogenous fungal degradation was a common phenomenon, which is manifested by reduced or lost conidial production capacity, decreased virulence , and reduced secondary metabolite synthesis ability , etc. Isaria
fumosorosea aftersubcultureseverelydegradedinconidialproductionandvirulence ．Inthisstudy themediumwas supplementedwith 4differentnutrients ．Theresultsshowedthatthevirulencerecoveryofthestrainwasthebest after rejuvenation with chitin medium. At the 10th generation , the LT50 decreased from 5. 86 d of the original
strain to 3 32 d. The Plutella xylostella larvae had a corrected mortality higher than 82% on the 7th day , and the recovery ratio was stable ； the conidial production of the strain recovered best after rejuvenation with the silkworm
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chrysalis medium, increasing from 4. 28X106 conidia/cm 2 of the original strain to 1.73X 107 conidia/cm 2, which
increased by three ttmes , but the recovery of virulence was poor ； the recovery of two indicators after the
rejuvenation with cicada medium was unstable. The comprehensive medium added with three kinds of nutrients had a good recovery effect on both virulence and conidia production , and the 10th generation LT 50 was 3.53 d and
condalproductonwas 1.58X107conda /
cm 2.Keywords Isariafumosorosea
； rejuvenaton ； vrulence ； condaproducton
虫生真菌是一类重要的昆虫病原微生物，但经
多次继代培养后，常常会发生菌落颜、生长形式等 的变化，特别是产抱能力下降甚至丧失，进而导致虫 生真菌的毒力大幅度降低，这种表型退化、表型不稳
定、表型恶化、双重表型、突变和衰变均可称为菌株
退化［12。虫生真菌退化的原因多种多样，据樊美珍 报道，菌株本身遗传物质改变及培养基成分和环境
条件的影响可导致菌株退化闪；李琳等図通过比较 转录组学研究发现，绿僵菌中一些参与胁迫响应和
衰老的相关基因在退化菌株中显著上调，推测退化
菌株表现为老化现象，发现活性氧（ROS ）引起的线 粒体损伤是导致菌株退化的机制之一；此外，转座子
随机插入，真菌双链RNA 病毒的入侵或者染体 的缺失等均可导致菌种退化。但这些原因都不能很
好地解释真菌退化的频率远远超过这些事件发生的
概率，且不同菌株退化频率也不尽相同，因此人们尝
中国梦想秀2012收稿日期：2020-03-20 修订日期：2020-05- 22
基金项目：山西省自然科学基金（201801D121253）；山西省重点研发计划（201903D221021）
*
通信作者
E-mail ：zxh6288@126
47卷第2期郭恒等：不同培养基对玫烟棒束抱菌株的复壮研究・151・
试通过多种方法恢复菌种原有性状。
虫生真菌频繁发生的菌种退化，成为其大规模生产应用所面临的重要问题，也为菌种保藏工作带来很大的困难。研究表明，虫生真菌可采用虫尸接种、宿主感染、培养基分离、培养基添加外源营养物质等方法复壮。如邹东霞等［2采用马尾松毛虫Dendrolimus punctatus Walker虫尸对球抱白僵菌Beauveria bassiana(Bals.-Criv.)Vui ll.BD-10-4菌株进行了复壮；马元伟等1通过培养基中添加外源氨基酸对罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii J.
F.Bisch.,S.A.Rehner&Humber ARSEF2575菌株进行了复壮，并有效延缓了蛹虫草Cordyceps militans Link01菌株的退化；Bult等5研究发现经过大蜡螟Galleria mellonella Linnaeus和黄粉虫Tenebrio molitrr Linnaeus2种易感菌寄主回接的金龟子绿僵菌M.anisopliae(Metschn.)Sorokin 菌株毒力比人工培养基上培养的显著增强；李亚洁等［2采取组织分离、抱子分离对蛹虫草进行了复壮等。
玫烟棒束抱Isaria fumosorosea Wize属虫草菌科棒束抱属，可寄生8目40多种昆虫，尤其对蚜虫、
粉虱等刺吸式口器害虫有很强的致病力，所以在害虫生物防治中有着非常重要的作用7102。目前，国内外对玫烟棒束抱的研究报道主要集中在生物学、分类鉴定、致病力测定、致病机理、防治应用等方面［1122，对菌株的复壮或预防菌株退化方面的研究鲜有报道。为此，本试验采用培养基添加外源营养物质的方法对玫烟棒束抱退化菌株进行复壮，旨在探寻简便而有效的复壮方法，为玫烟棒束抱的规模化生产和开发利用提供生产用菌株。
I材料与方法
II材料
III供试菌株
玫烟棒束抱菌株PF904为山西农业大学农学院农业害虫防治研究室经多次转接后退化的菌株。1.1.2供试培养基
本试验所用培养基及配方见表1。
表1供试培养基及组分
Table1Components of the test media
供试培养基Testmedium
用量Amount
蒸馏水/mL
Disti l ed
water
马铃薯/g
Potato
琼脂/g黑龙江文艺频道乡亲乡爱
Agar
葡萄糖/g
Glucose
蚕蛹粉/g
Silkworm
pupal
powder
蝉蜕粉/g
Cicadaecdysis
powder
甲壳素粉/g
Chitosan
powder
PDA10002002020———蚕蛹培养基Silkworm chrysalis medium1000200202010——蝉蜕培养基Cica
da ecdysis medium10002002020—10—甲壳素培养基Chitin medium10002002020——10综合培养基Comprehensive medium10002002020555 1)“一”表示无此成分。
“一”indicates no such component.
1.2方法
1.2.1菌株复壮
将供试菌株分别接种于上述5种培养基上，培养7d后转接至相同的新培养基上，共转接10代。每代每种均重复3次，测定数据取平均值。
1.2.2菌株生长量测定
使用电子游标卡尺在培养皿上以十字交叉法，对不同培养基上的菌落直径进行测量，每代培养至14d时记录数据。
1.2.3菌株产孢量测定
将培养好的菌株，利用直径为7mm的打孔器在固体平板培养基上菌落的中央至边缘1/2处打孔取样，
放入有10mL0.05%吐温-80无菌水中，使用涡旋振荡仪将抱子充分洗脱混匀，然后用灭菌纱布过滤。利用血球计数板计数测量，换算成单位面积的抱子产量。每种培养基各取3个平板作为重复。
1.24室内毒力测定
将培养好的菌落，用10mL0.05%吐温-80无菌水洗脱适量抱子，分别制成抱子含量为107个/mL的抱子悬浮液，采用浸虫法进行室内毒力测定。选取生长一致的小菜蛾3龄幼虫，浸入抱子悬浮液中10s 后取出，用滤纸吸去虫体上多余的菌液，然后放入有
• 152 •
2021
甘蓝叶片的9 cm 无菌培养皿中，每皿20头，保持皿
内湿度。各试验处理重复3次，并用0. 05%的吐
温80溶液作为对照处理。连续观察7d，记录死亡虫
数，并将死亡的虫体挑出，保湿培养，死亡虫体变僵硬 并长出菌丝视为有效感染死亡，并计算校正死亡率。
校正死亡率=（处理死亡率一对照死亡率
）
（1—对照死亡率）X100%o
1.2.5恢复比例测定
试验过程中对菌株产抱量以及毒力两项指标的 恢复情况进行比较，并取测定数据的平均值分别计算 得出相应恢复比例。试验共复壮培养10代，每培养 5 代测定一次, 分别在第5 代和第10 代测量2 次。
复壮培养至第5代时产抱量及毒力恢复比例：
恢复比例=I 第5代菌株测定值一初始菌株测
定值/初始菌株测定值。
复壮培养至第10 代时产抱量及毒力恢复比例：
恢复比例=I 第10代菌株测定值一第5代菌株
测定值 /第 5代菌株测定值。
1.2.6数据处理
试验数据均使用IBM SPSS Statistics 20. 0软
件和 Excel2010 软件进行分析处理。
2结果与分析
2.1玫烟棒束孢菌落形态的变异
随着传代次数的增多,PDA 上培养的玫烟棒 束抱菌落浓密的同心圆纹逐渐消失，有的菌落产生 扇形条纹，且伴有菌落质地变疏松、稀薄，抱子层变
薄的现象，菌落颜逐渐失去原有的浅粉而变为白 ，菌落形态也由绒毛状变为絮状。但在复壮培养基
上这些现象只在前5代偶有发生，且气生菌丝生长较
PDA 培养基少，说明添加营养物质的复壮培养基对于
延缓和预防菌株退化变异具有一定的作用。2.2不同培养基对玫烟棒束孢菌落生长的效果
通过对培养14 d 后的玫烟棒束抱菌落直径
的对比发现，甲壳素培养基上的菌落生长速率较快
且稳定，从第4代开始与对照PDA 培养基具有显著
性差异，从第6代开始与其前4代具有显著性差异,
培养至10代时菌落直径最大，达69. 33 mm，各代平
均为65. 39 mm 。其次是蚕蛹培养基，从第4代开始 与其第2 代具有显著性差异, 但之后6 代生长速率
变慢，各代平均为63. 18 mm 。综合培养基上的生长 速率也较为稳定，但复壮过程中，每2代之间直径变
化幅度较小，14 d 时菌落直径为59. 22
〜
64. 45 mm，平均为61 55 mm，波动较小。蝉蜕培养
基上菌落的生长速率代际间不稳定，在复壮过程中
生长时快时慢，直径范围在60. 38
〜66. 51 mm 之间
（表2）。总体上每种培养基上的菌落直径均随传代
次数的增加而逐渐增加，菌丝生长量也增大，其中甲 壳素培养基对菌落生长具有明显的促进作用，具体
原因还需进一步研究。
表2玫烟棒束砲在不同复壮培养基生长14 d 菌落平均直径1
1) PDA 培养基作为对照并未进行继代培养，数据为初始菌株菌落直径的平均值。同列数据后不同小写字母表示相同培养代不同培养基处 理间差异显著；同行不同大写字母表示相同培养基不同培养代间差异显著C P V0.05)。
PDA medium as a control is not subcultured, and the data are the averages of the original strain colony diameters. Different lowercase let ters in the same column indicate significant difference in the same generation on the different rejuvenation media. Different uppercase lett
ers in the same row indicate significant difference in the different generation on the same rejuvenation media (P <0. 05).
Table 2 Average diameters of Isaria fumosorosea colonies grown on different rejuvenation media for 14 days
供试培养基
Testmedium
菌落平均直径/mm Average diameter of colony
第2代 第4代 第6代 第8代 第10代
2ndgeneration 4thgeneration
6thgeneration 8thgeneration 10thgeneration (60. 53士0. 76)C (59.44士0. 48)D
(62. 82士0. 61)C (61 39士0. 55)bC (65. 95士0. 56)B (64. 63士0. 75)B (68. 36士0. 68)A (63. 44士0. 52)B 甲壳素培养基 Chitosan medium
蚕蛹培养基 Silkworm chrysalis medium 蝉蜕培养基 Cicada ecdysis medium
综合培养基 Comprehensive medium
PDA
(60. 38士0. 59)C (59. 22士0. 67)B (63. 57士0. 70)B (61 08士0. 36)bB (62. 78士0. 62)bB (60. 04士0. 78)B (60.47士0. 54) aA (60. 47士0. 54)bA (60.47士0. 54)A
(66. 51士0. 75)bA (63. 14士0. 66)A (60. 47士0. 54)dA (69. 33士0. 79)A
(66. 72士0. 63)bA (65. 83士0. 97)bA (64.45士0. 59)A (60.47士0. 54)dA
2.3玫烟棒束孢在不同培养基上的产孢量4 种不同培养基复壮后玫烟棒束抱的产抱量
如图1所示。从第2代开始经4种培养基复壮后的
菌株，产抱量与初始菌株具有显著性差异。经蚕蛹
培养基复壮的菌株，产抱量恢复效果最好，在复壮培
养过程中产抱量一直处于最高水平，从第8代开始
与其他3 种培养基产抱量均具有显著性差异, 连续
复壮10代后，菌株产抱量可达1 73 X 107个/cm 2,
47卷第2期郭恒等：不同培养基对玫烟棒束抱菌株的复壮研究
・153・
提升3倍之多。综合培养基上的产抱量仅次于蚕 蛹培养基，台终与甲壳素培养基和蝉蜕培养基的产
抱量具有显著性差异，连续复壮培养10代后，综合 培养基产抱量为1. 58 X 107个/cm 2。甲壳素培养
基复壮的效果次之，单位面积产抱量为1. 33X
107个/cm 2。效果较差的是蝉蜕培养基，复壮10代 后与其他3 种培养基均具有显著性差异， 产抱量仅
为初始菌株的2.6倍。
u o g o n p o jd
U J O d s
匚
Glue
•
2018
1614
12
10
靈初始菌株
Original strain
画蝉蜕培养基
Cicada ecdysis medium
■蚕蛹培养基
Silkworm chrysalis medium
翅甲壳素培养基
Chitin medium
畐综合培养基
Comprehensive medium
复壮代数/代
Rejuvenation generation
a
10
初始菌株作为对照并未进行继代培养，数据为初始菌株产砲量的平均值。同组中不同字母表示差异显著(尸＜0.05) The original strain as a control is not subcultured, and the data are the averages of spore production of the original strain. Different letters indicate significant difference in the same group (尸＜0.05)
图1不同复壮培养基上培养不同代数玫烟棒束孢产孢量的变化
Fig. 1 The change in Isaria fumosorosea spore production on different generations on different rejuvenation media
24玫烟棒束抱在不同培养基上的毒力
结晶氯化铝
复壮后的玫烟棒束抱菌株对小菜蛾幼虫的致
死中时(LT%)和校正死亡率如表3所示。小菜蛾幼
虫接种不同培养基复壮的菌株后，第3天幼虫出现
死亡，对照也有个别幼虫死亡，第4天开始有僵虫出
现，死亡率随着接种时间逐日递增，各菌株侵染7 d
后，大部分幼虫死亡，个别结茧化蛹。
如表3所示，4种复壮培养基均表现出明显的
复壮效果，致死中时(LT% )均显著小于初始菌株，其
中，甲壳素培养基复壮的菌株毒力恢复效果最好，连
续复壮10代后，菌株对小菜蛾的致死中时由初始菌 株的5. 86 d 下降为3. 32 d，与其他3种培养基均具 有显著性差异， 校正死亡率也具有显著性差异， 在第
7天的累积校正死亡率达82%以上；其次是综合培
养基复壮,LT 50第10代下降为3. 53 d，在处理后第 7天累积校正死亡率也达76%以上；蝉蜕培养基毒
力恢复效果次之；效果最差的是蚕蛹培养基，复壮菌
株对小菜蛾幼虫的LT 50和校正死亡率与其他3种
培养基复壮的菌株相比均具有显著性差异，且复壮
10代后，第7天的累积校正死亡率仅为68 26%。
表3不同复壮培养基培养的玫烟棒束抱菌株对小菜蛾3龄幼虫的致病力1
1) PDA 培养基作为对照并未进行继代培养，数据为初始菌株测定的平均值。同列数据后不同字母表示差异显著(P V0. 05)。
PDA medium as a control is not subcultured , and the data are the averages of the measurements for the original strain. Different letters indicate significant difference in the same column(P V0. 05).
Table 3 Pathogenicity of Isaria fumosorosea strains cultured on different rejuvenation media to
the 3rd-instar larvae of Plutella xylostella
供试培养基
骨传导
Test medium
校正死亡率(7 d)/%
Corrected mortality (7 d)
LT50
第5代
5thgeneration
第10 代
10thgeneration 第5 代
5thgeneration
第10 代
10thgeneration 甲壳素培养基 Chitin medium (69. 82士 1. 45)a (82. 38士 1. 14)a (4 35士0 14)c
(3. 32士0 10)d 蝉蜕培养基 Cicada ecdysis medium (63. 03士0. 97)b (74. 79士0 90)b (4. 43士0 16)c (3. 56士0 14)c 综合培养基 Comprehensive medium (62. 41 士 1. 09)b
(76. 67士 1 03)b (4. 45士0 11)c (3. 53士0 15)c 蚕蛹培养基 Silkworm chrysalis medium
(58. 19 士 1 52)c (68. 26士 1 31)c (4. 62士0 09)b (3. 98士0 12)b PDA
(47. 36士 1 76)d
(47. 36士 1 76)d
(5. 86士0 18)a
(5. 86士0
18)a
•154•2021
2.5玫烟棒束孢在不同培养基上产孢量及毒力
恢复比例
比较菌株经4种培养基复壮10代后，菌株产抱量和毒力（致死中时LT50）的恢复比例如表4所示。玫烟
棒束抱菌株在经过不同培养基复壮后，菌株的产抱量和毒力均有大幅提高，总体趋势呈现复壮1〜5代恢复比例较高,5-10代恢复比例有所下降。
经10代复壮，甲壳素培养基恢复比例较为稳定，下降速率比其他3种培养基低，恢复效果较稳定。而蚕蛹培养基两项指标的恢复比例均在培养过程中下降幅度较大。
在产抱量方面，初始菌株经过蚕蛹培养基5代复壮后，恢复比例可达126.8%，之后5代的恢复比例下降为87.4%，但与其他复壮培养基恢复比例相比均为最高值。在毒力方面，初始菌株经过甲壳素培养基5代复壮后，恢复比例为25.77%，之后5代复壮恢复比例仅下降为23.68%，与其他复壮培养基恢复比例相比也均为最高值。
表4不同复壮培养基上菌株的产砲量及毒力恢复比例膨胀螺栓
Table4Recovery ratios of spore production and virulence in different rejuvenation media
供试培养基Testmedium
产抱量恢复比例/%
Recoveryratioofsporeproduction
毒力恢复比例/%
Recovery ratio of virulence 第5代
5thgeneration
第10代
10thgeneration
第5代
5thgeneration
第10代
10thgeneration
甲壳素培养基Chitin medium87971825772368蝉蜕培养基Cicada ecdysis medium78157424411964综合培养基Comprehensive medium111283524062067蚕蛹培养基Silkworm chrysalis medium126887421161385
3结论与讨论
3.1产孢量
虫生真菌菌株的产抱量是衡量菌株活力的重要指标之一。菌株具有较高的产抱量和高质量的抱子是其可以应用于大规模生产的必备条件。据报道，培养基是影响微生物生长和繁殖的重要因素之一，即营养对菌株生长和产抱有很大影响，若不能满足菌落生长的营养条件，许多菌株就不能生长或产抱［314］。浦静等［15］研究发现，培养基中以麦芽糖为碳源可能更利于玫烟棒束抱菌株产抱；此外培养基中添加适量的动物性氮源也有助于菌株产抱口6］。本试验结果表明，添加含氮量较高的动物性氮源蚕蛹粉的培养基使供试菌株的产抱量恢复最好，其次是综合培养基和甲壳素培养基复壮，蝉蜕培养基复壮效果最差。这可能和培养基中动物性氮源含量有关，具体原因有待进一步探索。
32毒力
虫生真菌菌株的毒力是衡量菌株应用潜力的重要指标。蔡国贵等［17］研究发现，菌株在营养丰富的培养基中生长相对稳定，在营养贫瘠的培养基中生长则容易变异，不同培养基通过影响菌株酶的表达水平引起菌株毒力的变化；李会平等口&研究发现，白僵菌菌株产酶能力与其对桑天牛幼虫的毒力呈正相关关系，培养基成分和培养条件会影响菌株的产酶能力，进而影响菌株毒力。甲壳素粉中蕴含的磷脂与蛋黄素可促进分生抱子的萌发和有效侵染，且稳定甚至增强菌株毒性口9。本结果发现，供试
菌株经甲壳素培养基复壮后对小菜蛾幼虫毒力恢复效果最好，这可能是因为玫烟棒束抱菌株在吸收其营养后，能较好地诱导菌株产生几丁质酶，并增强了该酶的活性有关™。
3.3恢复比例
分析试验结果发现，在多次复壮的过程中，4种培养基均表现出了随着复壮代数的增加产抱量和毒力的恢复效果逐渐减弱的现象，但是甲壳素培养基具有相对较好的稳定性，恢复效果的下降速率较慢，原因可能是几丁质是真菌细胞壁的主要组成成分，对菌株的生长发育必不可少，同时也提高了菌株体内几丁质酶的活力［0］。其次是综合培养基恢复效果较好，可能是综合培养基具有更多种营养物质，形成了稳定的组合，能让菌株吸收不同性状生长所需要的营养。而蝉蜕培养基在复壮过程中对菌株2个指标的提升比例均不突出。此外添加蚕蛹粉的培养基仅使菌株在产抱量方面有大幅度提高，在毒力方面复壮效果不突出，且恢复比例波动较大，可见其稳
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