《生物制药技术》实验指导
哥白尼革命
实验目的：
掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。
实验原理：
层析（谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭
、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而 均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。
薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层谱法具有
分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。
材料、试剂和器材：
仪器和设备：
玻璃层析缸；层析板 （薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子）
试剂：
四环素、金霉素标准品（1000U/ml） 用0.1 M盐酸溶解并稀释定容，4℃冰箱保存（可使用7天）。
展开剂：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5) 2L。
草酸、氨水
其它物品：
1.5ml离心管、小烧杯、玻璃棒、毛细玻璃管或微量注射器、pH试纸（pH覆盖1.0～2.0）（或酸度计）、饭盒（或大培养皿）、凡士林
实验步骤：
1．层析板处理
层析板105℃烘烤过夜，均匀喷上0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH4.5)，于空气中晾干、备用。
2．点样
选取两种定向发酵液加草酸酸化至pH为1.5～2.0，取上清约l .2 ml于1.5ml离心管中，1000
0 rpm，5min，备用。在距层析板底边2.5~3 cm起始线上(用铅笔划线，做出点样点记号)，用毛细玻璃管在薄层层析板上点四环素标准品和金霉素标准品溶液3次，发酵液上清点8～10次，点样点不大于0.4cm，每次都要吹干后再点。（一般效价在1000u／ml以上点3次，500～1000u／ml点4次，200～500u／ml点5次）。剩余的发酵液上清于4℃冰箱保存。
3. 层析（展开）
用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展开剂。层析前需预先用展开剂预平衡层析缸，可在缸中倒入2cm高的展开剂，密闭，一般保持15－30分钟。然后将层析板置于盛有展开剂的层析缸中，在室温下展层6～8h（与温度有关）。封口不严可涂抹凡士林。
4．荧光显影
待溶剂前沿展至板的一半以上时将层析板取出，标出溶剂前沿，于通风橱中晾干，用氨水熏数秒钟后即可在紫外灯下显影，画出黄斑点，分别算出Rf值。（四环素标准品慢和金霉素标准品快）
无水四环素在波长365nm下显黄荧光，根据与标准对照可定性测定。
注意事项：
因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四环素尽量溶解。
点样时必须注意勿损伤薄层表面。要控制好点样量，样品太少，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大或拖尾现象。松下vs7
若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。
作展开剂中极少量强极性溶剂(0.5％)或pH值的改变可显著改善拖尾现象。
实验四 四环素的效价测定（综合型）
实验目的：
1、了解抗生素效价的表示方法
过氧化氢异丙苯2、学习抗生素的测定方法
实验原理：
实验利用比法测定四环素和金霉素的效价。效价(titer或titre)是评价抗生素效能的标准，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，也是衡量发酵液中抗生素含量的尺度，人们以1µg金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。
四环素和金霉素在酸性条件下，加热，可产生黄的脱水金霉素和脱水四环素，其度与含量成正比。
泥浆护壁原理
在碱性条件下，四环素较稳定，而金霉素则生成无的异金霉素：
根据上述原理，可以在酸性条件下，利用比法测定四环素、金霉素混合液的总效价；而四环素效价的测定可在碱性条件下，使金霉素生成无的异金霉素，然后再在酸性条件下，使四环素生成黄的脱水四环素，经比测得四环素效价。总效价与四环素效价二者之差即为金霉素的效价。本实验只测定四环素的效价。
因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四环素尽量溶解。发酵液中，由于杂质的干扰，将影响比的正确性，因此加入乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)作为螯合剂，掩饰金属离子的干扰，改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)，可以减少杂质对比反应的干扰。
材料、试剂和器材：
试剂：
EDTA lg／l00ml、NaOH 3mol／L、HCl 6mol／L、蒸馏水
盐酸四环素标准液: 精密称取盐酸四环素标准品0.0410 g 于烧杯中, 用适量蒸馏水(或0.1mol／L的盐酸溶解)溶解, 转移至200 m l容量瓶中定容配成0.2 m g /m l的溶液。
器材：
分光光度计、玻璃比池、水浴锅、电炉、不锈钢锅、擦镜纸、50ml容量瓶（或比管）、大烧杯、移液、1mL头、洗耳球
实验步骤：
取上述保存的处理发酵液上清l ml (效价约为1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml浓度为lg／l00ml EDTA溶液，加蒸馏水9ml，再加入lml浓度为3mol／L的NaOH，在20~25℃下保温15min后，加入2.5ml浓度为6mol／L的HCl，煮沸15min后，冷却，稀释至刻度，在分光光度计上于440nm（或380 nm）处测定其吸光度值。（紫外为100-390nm；可见光为380-780nm，根据波长选择石英比池或玻璃比池，否则玻璃对于紫外光有吸收）穿膜肽
对照样品（不加诱导剂）的前处理方法与上述步骤一样，只是在加入HCl后，不加热，稀释至刻度，作为测定样品的空白对照, 调零。
取1ml四环素标准品于50ml容量瓶中，加1ml浓度为6mol／L的HCl，水浴煮沸15min后，冷却，稀释至50ml，440nm（或380 nm）测吸光度。（以蒸馏水作为空白测定）
以定向发酵培养基中的对照组作为空白对照，测定其它三个处理组的吸光度。（有时可能因对照组处理不当而使其它组的读数为负值，这时可以以蒸馏水作为空白。）
计算公式：
发酵液中四环素的效价= | A发酵 | ×四环素标准品的效价 |
A四环素标准 |
| | |
林达尔均衡
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