G418筛选稳定表达细胞系总结⼀
分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染⾄宿主细胞染⾊体。外源基因进⼊细胞后，部分能够通过细胞质进⼊细胞核内，根据细胞类型，⾄多80％的进⼊核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进⼊细胞的外源DNA通过系列⾮同源性分⼦间重组核连接，形成巨⼤的***结构最终整合进细胞染⾊体。细胞基因组⾃由部分表达，所以整合并不⼀定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，⽽且整合到不同的染⾊体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是⼩概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。⼀般情况下这种新表型由共转染的编码抗⽣素抗性基因提供。细菌Tn5转座⼦序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成⽆毒形式。 G418是⼀种氨基糖类抗⽣素，其结构与新霉素、庆⼤霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能⽽阻断蛋⽩质合成，对原核和真核等细胞都有毒性 ，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ，也包括原⽣动物和蠕⾍。是稳定转染最常⽤的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地⽅后 ，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从⽽获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的⾼效表达 ，使细胞获得抗性⽽能在含有Ｇ418的选择性培养基中⽣长。Ｇ418的这⼀选择特性 ，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等⽅⾯得以⼴泛应⽤。
在进⾏转染时细胞膜受到影响，抗⽣素可能对细胞产⽣较⼤影响，加上G418有杀菌作⽤，所以有⼈主张转让时不加其它抗⽣素。其实G418本⾝有很好的杀菌效果，在⽤G418进⾏筛选的过程中很少会发⽣污染。但有⼀点，其实我觉得问题也不是很⼤，那就是：在⽼外的⼀本实验⼿册中提到，在脂质体转染时所⽤培养基中最好不加任何抗⽣素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗⽣素对细胞损伤较⼤。因为庆⼤霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理
作⽤完全⼀样。所以没有必要再⽤，⽽且由于另外抗⽣素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗⽣素对细胞培养与筛选影响不⼤。
有⼈认为⽤磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合⼦较好，但这种观点是很多年以前的观点了，⽽且只是少数⼈的观点。我两种⽅法都⽤过，但没有特异的⽐较过，感觉都可以。磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作要求很⾼，尤其是溶液的PH 值，要求精确到⼩数点后2位。脂质体是现在主流的转染试剂，从没有⼈说这种⽅法做整合稳定表达不⾏。⾮脂质体是这⼏年发展很快的技术，转染效率低，细胞毒性⼩，价格也不贵，Qiagen就有⼀个系列。我个⼈觉得不必要花太多时间在这⽅⾯，⾃⼰实验室⽤得好的技术可以坚持，没有经验的可以选择⼀个较著名的公司的产品开始，购买之前先下载个说明书看看。有精⼒就⽐较⼀下⼏种⽅法，⼀般的⽤达到⽬的就⾏了。关键是实验设计。
G418和筛选：筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，⽽且不同的⼚家⽣产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，⼀定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进⾏筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进⾏下⼀步的筛选试验。由于每种细胞对G418的敏感性不同，⼀般变动在100ug/ml～
1000ug/ml范围。⽽且不同的⼚家⽣产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，⼀定要确定你的细胞对这⼀批G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳⽤量还是稳定的。《分⼦克隆》给出了⼏个常⽤细胞系所需G418的最佳⽤量。
看下⾯的⼀个试验：3×106个细胞电转后，分别接种
1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48 h后加药筛选，此时1/300细胞孔内⼤约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按⽐例1/300孔内应该有⼏⼗个克隆，事实上，它们⼏乎全死光了，只有⼏个克隆。所以汇合度对G418筛选结果的影响很⼤，⼀般筛选时汇合度不宜超过50%！
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要⼀段时间才能表达出蛋⽩质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较⼤，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转⼊的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，⼀般要在转染24⼩时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换⼀次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降⾄200ug/ml。
培养液
神龙赋加药筛选约6天左右，细胞会⼤量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥⽆⼏。这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即⾮选择性死亡。2.孔中细胞数⽬很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚⾄死亡。这个时候需要⼀种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备⽤。再转染后筛选过程中就可以应⽤这
种培养基。
挑选单克隆的优化
为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应⽤套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在⾼倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下⽤记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或则⽤套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋⽩酶或EDTA消化，把消化液吸到另外⼀个新的孔中培养。最后再⽤有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
鉴定之后
⼀般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都⽐较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，⽬的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太⼩了，⽽且是随机整合，会导致表达的⽬的蛋⽩的量产⽣很⼤差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达⽬的基因的细胞会占据优势，强表达⽬的蛋⽩的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能到那种我们想要的强分泌⽬的蛋⽩的，遗传稳定的细胞克隆。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结！（2）
1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏⽔⾄10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种⼊多孔培养板中，培养6⼩时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定⼏个梯度，⽐如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、
1000ug/ml，按梯度浓度⽤培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤⼀次，每孔中加⼊不同浓度的筛选培养基。
南京信息工程大学学分制管理系统5.换液：根据培养基的颜⾊和细胞⽣长情况，每3~5天更换⼀次筛选培养基。⽅法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最⼩G418浓度即为最佳筛选浓度。在第⼀轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不⼤，最有可能的是出现这种情况：⽤某⼀浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，⽽⽤下⼀个梯度的
G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，⽽800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再⽤500ug/ml、600ug/ml、
700ug/ml进⼀步筛选，以确定最佳筛选浓度！⼼得：由于特性明确的细胞系G418的最佳⽤量还是⽐
较稳定的，所以有时候不需要在这么⼤范围内进⾏筛选。⽐如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我⽤的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进⾏筛选。
通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。
a 转染：转染后培养24⼩时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增⾄50％～70％汇合时；
b 加G418：去掉培养液，PBS洗⼀次，加⼊按最佳筛选浓度配制好的
G418筛选培养基。
c 换液：根据培养基的颜⾊和细胞⽣长情况，每3~5天更换⼀次筛选培养基。当有⼤量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增⼤后；
d 挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，⽤培养基稀释细胞到1
个/10ul。在96孔板中加⼊培养基150ul/孔，再加⼊细胞悬液10ul/
孔。待其逐渐增⼤后转⼊到48孔中增殖。
e 单克隆鉴定：细胞⼤量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测⽬的基因是否存在。
常见问题：
1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的？
⽆怪乎两种形式：整合在染⾊体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前⼤部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合⼊染⾊体的才是我们想要的稳定细胞系。
<基因和⽬的基因是不是⼀定会整合在⼀起？
整合是随机发⽣的⾮同源性重组，neo基因表达⽽⽬的基因不⼀定都表达，所以在筛选之后还要⽤RT-PCR的⽅法进⼀步鉴定。
培养基处理的个⼈技巧
梁茂春体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有⼀个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作⽤，即
细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出⾃⼰的代谢产物和其它⼀些物质，其中有排泄物也有促细胞⽣长因⼦。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作⽤越强，所以细胞数⽬多⽐数⽬少较易⽣长。在筛选后期，⼤批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作⽤不强，也不利于⽣长。我是⽤适应性培养基来解决这⼀问题的：
适应性培养基的配制
a 培养同源细胞⾄半汇合状态时，更换⼀次培养液，再继续培养24～
48⼩时后，吸出所有培养液
b 离⼼：3000～4000rpm 10 min后，吸取上清液
c 虑过：再经直径0.22um滤器过滤，再加⼊2倍体积的新鲜培养基，
低温冻存备⽤。
eeflying
1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释⾄1000cell/mL，每
孔100uL加⼊有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释⾄
0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL
等12个级别。培养10-14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，⼀般400-800左右，筛选时⽐该浓度再⾼⼀个级别，维持使⽤筛选浓度的⼀半。
２. 我们掌握是传过10代以后⽤维持量，但不能不⽤，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。
３. 即是有G418抗性，也不⼀定有⽬的基因，单克隆化操作是很重要的。
转染后，每个细胞内⽬的基因与宿主染⾊体的整合状况是不同的，⽬的蛋⽩表达有的多，有的少，外源蛋⽩表达少的细胞由于代谢负荷较⼩，所以⽣长较快，在⽣长若⼲代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿⾊荧光蛋⽩基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进⾏单克隆化操作，使得到的均来⾃于同⼀祖先细胞，遗传性状尽量⼀致，也是对⾼表达细胞的保护。操作⽤96孔板法，每代细胞长满后，⼤多数冻存，留200cell左右就可以进⾏该操作了，该⽅法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。
1. 可以肯定的是，外源基因与宿主染⾊体之间的整合是随机的⽽且不是单拷贝的，这点我们做过FISH
验证过，表达量与整合数⽬，上游序列特性，特定部位DNA⽴体结构都是相关的，装⼊了SV40只是增加了表达了数⽬，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度⼀致，但实际上差别很⼤。neo基因也是这样，⽽且，同⼀细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同⼀基因的数⽬也不会相同，这点可以⽤数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但⽬的基因丢失了的情况也是有的。
2. 那为什么还要筛选基因？是这样，⽤概率论的思维来理解，某⼀细胞内随机含有⼀定数⽬拷贝数外源基因基因，那么，⼀种基因拷贝数
为0的可能性，及所有拷贝均为另⼀种基因的概率就很⼩，很⼤的概率为外源基因的不均质。打个⽐⽅，⼀个⼤⼝袋，抓100个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若⼲个，这些球均为红球的概率有多⼤呢？应该是很⼩的。红球就是neo，黄球就是你的⽬的基因。我们⽤neo，实际上是筛选的外源基因整合的数⽬，怎么说呢？⽤刚才的例⼦来说，如果我们抓着5个红球，另⼀次抓着10个红球，可以肯定，第⼆次抓的球⽐较多，那么第⼆次黄球数⽬⽐第⼀次多的概率就很⼤了。因为⼆者出现的
概率⽐是恒定的。
3. 维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔⼀定时间从新使⽤筛选量压⼀下，我不知你是否⼲临床，想想抗⽣素的⽤药原则，反向思维⼀下，实际上我们在筛选耐药株呀。
4. neo的产物是酶，过⾼的G418浓度就要有更多的neo酶来⽀持，否则细胞也要被毒死的，⽽此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太⼤负担，细胞可能因此⽆法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同⼀转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中⽣长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的⽐例关系嘛，这回不⽤数论的，⽤⽶⽒⽅程理解吧。
5. 胰酶的作⽤不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由⼏代之后，不受影响的细胞会占优势的。
仅是我从临床抗⽣素和化疗药的使⽤原则中悟出的道理，实在是个⼈经验，⽽且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业⼈⼠的理解和经验。
在第10天左右就⼿挑单克隆或者96孔板单克隆操作了
本帖开始我就讲了如何确定基准浓度，筛选浓度是基准浓度的⾼⼀级，维持⽤筛选浓度的⼀半。
2、核酸贮存液，过滤除菌。
3、培养基：含⾎清或不含⾎清的，⽤于转染细胞的正常培养。
vba宏语言⼆、操作步骤
（⼀）克隆⽬的基因
1、根据GenBank检索的⽬的基因序列，设计扩增引物，G418筛选稳定表达细胞系总结
汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养表⾯的⽐例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。
最近的⼀个实验是：3×106细胞电转后，我把电激杯中的细胞分别接种1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48⼩时后加g418筛选，这个时候接种了1/300细胞的孔会⼤约50%汇合，⽽理论上接种了1/4000细胞的孔
会4%左右汇合，今天是筛选后第9天，观察到1/4000孔有两三个⼩克隆，按道理1/300孔会有20-30个克隆，但实际的情况是它们⼏乎全部死光了，仅有少数存活细胞！
所以我认为汇合度对g418筛选影响很⼤，这耽误了我将⼀个多⽉。jiangql同意菊花与⼑对你的建议。我的感觉G418筛选时间太长，到后来⼀般会对细胞⽣长有影响。以下是⼀些建议，供参考：
⾸先需要扩增细胞，冻存部分中间产物细胞后，再做克隆化⽐较合适，否则⼀旦污染就会全军覆没。
⼀般5～7天后G418就可以减半维持。
勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。
⾎清浓度可以⾼到20％，质量要好。
扶绥中学进⾏真核转染的⼀般程序：
克隆⽬的基因（经测序验证）—准备真核表达载体－将⽬的基因插⼊表达载体中－转染－筛选－鉴定
下⾯以pcDNA3为载体，p16为⽬的基因，介绍真核转染的实验操作。
⼀、试剂准备
1、 HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加
⼊1M Hepes，调pH到7.4，补ddH2O⾄100ml, pH7.4，滤过除菌。
并在上、下游引物的5’-端分别引⼊酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，⾏RT-PCR。
2、回收特异性扩增⽚段，连⼊T载体。
3、转化DH5α，质粒制备。
4、酶切初步鉴定，测序证实。
（⼆）真核重组表达载体的构建：
pcDNA3载体带有在⼤肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗⽣素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。
重组质粒与pcDNA3分别⽤BamHⅠ和XhoⅠ双酶切
回收插⼊⽚段和pcDNA3线性⽚段
T4连接酶连接
转化DH5α
中国公路学报
质粒制备
BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。
（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：
1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418 分别
⽤100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加⼊，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。
2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的⽣长率和细胞形状⽽定。进⾏转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。⼀般要求，6孔培养⽫（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同⼤⼩培养板调整每平⽅厘⽶的细胞数量。
典型贴壁细胞平板密度
3、 SHG-44细胞的转染：
(1) 转染当天，加⼊脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有⾎清或⽆⾎清培养基。
(2) 准备不同⽐例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳⽐例。①溶液A：⽤HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5µg 到总体积50µl（30µg/ml）。②溶液B：⽤HBS稀释6µl脂质体到终容积50µl（120µg/ml）。③混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。
(3) 不要移去培养基，逐滴加⼊100µl 脂质体/DNA混合物（从培养孔⼀边到另⼀边），边加边轻摇培养板。
(4) 37℃孵育6hr。
(5) 6hr后更换转染培养基，加⼊2-3ml新鲜⽣长培养基。
(6) 转染24hr后施加筛选压⼒，改⽤含G418的培养基培养。
4、 G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩⼤培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。G418筛选稳定表达细胞系总结
（⼀）筛选结果鉴定：
（1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因
（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋⽩表达（Western-blot）。
（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响
①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染⾊→上机分析G1期和G2/M、S期⽐例。
②细胞⽣长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组
pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各⾃⽤苔盼蓝染⾊计数细胞
→计算细胞⽣长抑制百分率。
③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。
三、注意事项
1、优化转染条件（脂质体的⽤量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进⾏。⽤于转染的核酸应⾼度纯化。为避免微⽣物污染，所⽤溶液滤过灭菌，以及随后的使⽤应在⽆菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物⽆需滤过除菌。
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