基因组DNA测序文库构建
1. 对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。 对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。
对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。
2. 用Qubit检测DNA样品浓度。
3. 吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，体积为130ul。用雅典传奇Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。
4. 样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。 5. 对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脱。回收产物用Qubit测值。
6. 修平和磷酸化
100ul体系
DNA 1ug
5 X T4 polymerase buffer 20ul
BSA (5mg/ml) 2ul
ATP (100mm) 1ul
dNTP（10mm） 10ul
T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul
Klenow（10U/ul） 1ul
T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul
22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。
7. 加‘A’
100ul体系
DNA 0.5-2.5ug
10 X klenow buffer 10ul
dATP(10mm) 1-3ul
Klenow(exon-)（5U/ul） 1-3ul
37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。
8. 连接头
200ul体系
10 X T4 DNA ligase buffer 20ul
PEG4000 30ul
ATP(100mm) 2ul
DNA X
接头 Y
T4 DNA ligase 1.5-2ul
加水至 200ul
DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10香港成人台之间。
9. 连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。
10. PCR扩增
10 X TagE buffer 5ul
Mgfeidele2+ 4ul
dNTP(10mm) 1ul
民事案件案由规定lib-PCR-F 0.5ul
lib-PCR-R 0.5ul
tagE 0.5ul
DNA 5ul
ddH2O 33.5ul
11. 琼脂糖胶回收。
12. Qubit测值，总量足够的情况下，取3ul跑胶检测。
13. 附录
T4 DNA Polymerase由于同时具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性，可以用于将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平。T4 DNA Polymerase的3'→5'DNA外切酶活性对于单链DNA要比双链DNA活性更高，即单链DNA要比双链DNA中的非配对链部分更容易被T4 DNA Polymerase所消化。T4 DNA Polymerase的3'→5'外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。 DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段) 是 E. coli DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物，具有 DNA
聚合酶活性和 3' →5' 核酸外切酶活性，但缺失了 5' →3' 核酸外切酶活性。Klenow 既保留了全酶的高保真性，又不会降解 DNA 5' 末端。注意：由于该酶具有 3' 激点文学→5' 核酸外切酶活性，升高反应温度、加入过量的酶、未加入 dNTP 或反应时间过长均会导致 DNA 末端碱基被切除形成凹陷。
T4 多聚核苷酸激酶能够催化磷酸在 ATP 的 γ-位和寡核苷酸链 (双链或单链 DNA 或 RNA) 的 5′-羟基末端以及 3′-单磷酸核苷间进行转移和交换，1 个 Richardson 单位，指 37℃条件下，30 分钟内1 U催化 1 nmol 酸不溶性 [32P] 掺入所需要的酶量 。
Klenow 片段（3´→5´exo- ）是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。它保留了 DNA 聚合酶活性，但失去了 5´→3´ 外切核酸酶活性。该酶经突变（D355A, E357A） 去除了其 3´→5´ 的外切核酸酶活性(1) 。1 单位指在 37°C条件下，30 分钟内能使 10 nmol 的 dNTPs 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。注意：Klenow 片段（3´→5´exo -）因去除了 3´→会商系统 5´ 外切酶的活性，故不适宜用于生成平末端的反应。当用于双脱氧法 DNA 序列测定时(3) ，建议用 1 unit/5 μl 反应体系。
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