T4 DNA Ligase ——Thermo scientific #EL0011
产品信息
特点
快速 – 室温下10分钟内完成粘末端的连接反应。余书华
∙该酶在Fermentas公司限制酶、PCR和RT缓冲液(添加ATP)中活性。
∙配套提供聚乙二醇溶液以有效进行平末端连接。
应用
克隆酶切产生的DNA片段。
∙连接双链寡聚核苷酸街头或连接物。
∙定点诱变。
∙扩增片段长度多态性 (AFLP)。
∙连接酶介导的 RNA 检测 (3)。
∙双链DNA，RNA 或 DNA/RNA 复合体中缺口的修复。
∙线性 DNA自身环化。
说明
T4� DNA Ligase催化双链DNA或RNA中毗邻的5’ -磷酸基团和3’-羟基末端之间形成磷酸二酯键。酶还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA复合体中的单链切口，连接DNA的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性 (1, 2)。 T4 DNA Ligase需要辅因子ATP。
浓度
1 Weiss u/µl = 200 CEU*/µl
5 Weiss u/µl = 1000 CEU*/µl
30 Weiss u/µl = 6000 CEU*/µl
* 一个粘性末端连接单位的是指在16°C 、30分钟内50%连接HindIII酶切的lamda DNA产物所需要的酶的量。
来源
含有T4噬菌体克隆基因30的大肠杆菌。
分子量
55.3 kDa，单体。
活性单位定义
1个活性单位是指在ATP-PPi交换反应中，37°C、20分钟内将1nmol [32PPi]转换为Norit可吸收形式所需的酶量(Weiss单位**(4)。
酶活性分析混合物：66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 0.066 mM ATP, 10 mM DTT, 3.3�µM [32PPi].
** 1个Weiss单位相当于约200个粘性末端连接单位。1个粘性末端连接单位：20� μl反应体系(50 mM Tris-HCl�(pH�7.5), 10 mM燤gCl2, 10 mM燚TT, 1 mM ATP, 25 µg/ml燘SA, 0.12 µM (300�µg/ml)的5’-DNA末 端)中， 在16°C、30分钟内50%连接HindIII酶切的Lambda DNA产物所需要的酶量。
保存缓冲液
保存缓冲液组分：
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA和50% (v/v)甘油。
10X T4 DNA Ligase 缓冲液(#B69)
400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8, 25°C)。
质量控制
相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。 功能检测：粘性末端或平末端DNA的连接能力。
粗钢抑制与失活
∙抑制剂：当反应体系中NaCl或KCl的浓度超过200� mM时，可强烈抑制T4 DNA Ligase活性。
∙失活：65°C加热10分钟或者70°C加热5分钟。
备注
∙聚乙二醇(PEG) 极大地增加平末端连接效率 (5) 。反应体系中的PEG 4000的建议浓度为5% (w/v)。
∙T4 DNA Ligase与DNA结合会改变条带的琼脂糖凝胶电泳迁移率。为避免此现象，电泳前需处理样本或分子量标准。样本处理方法如下：样本或分子量标准与Fermentas公司6X DNA Loading Dye & SDS溶液(#R1151)混合；70°C加热5分钟或65°C加热10分钟后冰浴保存。 ∙转化时，连接产物的体积不能超过感受态细胞体积的10%。
∙电转化之前，先用氯仿抽提方法除去连接混合物中的T4 DNA Ligase。然后经乙醇沉淀纯化抽提产物。
操作手册
DNA插入片段与载体DNA连接
1.反应体系配方如下：
组分 | 粘性末端连接 | 平末端连接 |
线性载体DNA | 20-100 ng |
插入片段 DNA | 与载体的摩尔比为1:1到5:1 |
10X T4 DNA Ligase buffer | 2 µl |
50% PEG 4000 溶液* | - | 2 µl |
T4 DNA Ligase | 0.2 µl (1 u) | 1 µl (5 u) |
水，无核酸酶 (#R0581) | 至 20 µl |
总体积 | 20 µl | 20 µl |
| | |
* 50% PEG 4000溶液随Fermentas T4 DNA Ligase配套提供(#EL0335，#EL0334)。
2.粘性末端：22°C孵育10分钟；平末端：22°C孵育1小时。
3.65°C热失活10分钟。
4.转化：每50 μl化学感受态细胞使用5 μl连接产物；每50 μl电转感受态细胞使用1-2 μl连接产物。
备注
：如需增加转化子数量：
∙如果连接产物的产量不够，建议4°C孵育连接过夜。
∙采用氯仿抽提替换热失活方法，平末端连接产物建议采用电转化方法。
线性DNA自身环化
1.反应体系配方如下：
线性载体 DNA | 10-50 ng |
10X T4 DNA Ligase buffer | 5 µl |
T4 DNA Ligase | 1 µl (5 u) |
水，无核酸酶 (#R0581) | 至 50 µl |
总体积 | 50 µl |
| |
2.充分混匀后短暂离心，22°C孵育1小时。
3.65°C热失活10分钟。
4.取大约5 μl连接产物转化50 μl化学感受态细胞。
备注
采用氯仿抽提替换热失活方法，平末端连接产物建议采用电转化方法。
接头连接
双链寡核苷酸接头常用于产生插入片段中没有的兼容性突出末端。接头含有限制酶识别位点，与目标片段连接后酶切可产生与克隆载体匹配的粘性末端。此外接头也可直接带有匹配的粘性末端，与克隆载体直接连接，无需额外操作。
1.根据应用不同，准备下列的反应体系：
组分 | 连接，用于后续酶切 | 仅仅连接 |
线性 DNA | 5 µl (100-500 ng) |
磷酸化接头 | 5 µl (1-2 µg) |
10X T4 DNA Ligase buffer | - | 2 µl |
限制酶用10X buffer | 2 µl | - |
ATP, 10 mM* | 1 µl (终浓度0.5 mM) | - |
50% PEG 4000 溶液** | 2 µl |
T4 DNA Ligase (#EL0334) 或 (#EL0335) | 0.4 µl 或 2 µl (2 u) |
水，无核酸酶 (#R0581) | 至 20 µl |
总体积 | 至 20 µl | 至 20 µl |
| | | |
* 混合10 μl 100 mM ATP溶液(#R0441)和90 μl水(无核酸酶，#R0581)制备10 mM ATP溶液。
**捷丰场站 50% PEG 4000溶液随Fermentas T4 DNA Ligase配套提供(#EL0335，#EL0334)。
2.充分混匀后短暂离心，22°C孵育1小时。
3.65°C热失活10分钟。
备注
连接产物酶切前无需纯化，可将限制酶直接加入连接反应混合物中。
T4 DNA Ligase活性分析对照反应
连接酶失活或样本DNA中的杂质会导致连接失败。推荐采用对照DNA(如：Lambda DNA/HindIII DNA Marker (#SM0101))的连接实验分析T4 DNA ligase的活性。
1.对照连接混合物准备：
Lambda DNA/HindIII DNA Marker (#SM0101) | 1 µl (0.5 µg) |
10X T4 DNA Ligase Buffer | 2 µl |
T4 DNA Ligase 黎氏三兄弟 | 1 u |
水，无核酸酶 (#R0581) | 至 20 µl |
总体积 | 至 20 µl |
| |
2.充分混匀后短暂离心，22°C孵育10分钟。
3.制备上样混合物：
连接产物 | 10 µl |
6X DNA Loading Dye & SDS Solution | 2 µl |
| |
图 1.对照实验评价T4 DNA Ligase活性。
1 – Lambda DNA/HindIII fragments, 未连接
楚生
2 – 连接后的Lambda DNA/HindIII
结果解释
●二茂铁甲醛出现更高分子量条带且低分子量条带变弱，表明连接酶有活性。
●连接后条带不发生变化，说明连接酶失活。
参考文献：
1Rossi, R., et al., Functional characterization of the T4 DNA Ligase: a new insight into the mechanism of action, Nucleic Acids Res., 25, 2106-2113, 1997.
2Cherepanov, A.V., et al., Binding of nucleotides by T4 DNA Ligase and T4 RNA Ligase: optical absorbance and fluorescence studies, Biophys. J., 81, 3545-3559, 2001.
3Nilsson, M., et al., RNA-templated DNA ligation for transcript analysis, Nucleic Acids Res., 29, 578-581, 2001.
4Weiss, B., et al., Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, J. Biol. Chem., 243, 4543-4555, 1968.
5Pheiffer, B.H., Zimmerman, S.B., Polymer-stimulated ligation: enchanced blunt- or cohesive-end ligation of DNA or deoxyribo-oligonucleotides by T4 DNA ligase in polymer solutions, Nucleic Acids Res., 11, 7853-7871, 1983.
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