一、实验目的
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、实验材料
水稻幼叶
四、主要试剂配方
2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M
EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇
（400ul）
氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。
五、实验步骤
1. DNA的提取
（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；
（3）投入产出法 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
（4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；
（5）置于山西科教公民与法65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；
（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；
（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
（8董时进） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
（10）60 sec后，直立离心管，加入720 μl的75%乙醇及80 μl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；
（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 μl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；
（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；
（14）加入50 μl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；
（15）置于-20℃保存、备用。
2. DNA质量检测
六、 注意事项
（1）叶片磨得越细越好。
（2）移液器的使用。
（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。
思考题：
1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA
2．提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？
实验二 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测 一、 实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、 实验原理
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：
PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1． 变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2． 退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3． 延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45狸御殿℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度
大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
三、实验材料及相关试剂
基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等
四、实验步骤
1．模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。
2．PCR操作 (在冰上操作)：
（1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 μL, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样：
反应物 | 加样顺序 | 体积/μL | 终浓度 |
ddH2O | 1 | 17.3×n | |
10 x Buffer | 2 | 2.5×n | 1 x |
25 mmol/L MgCl2 | 3 | 1.5×n | 1.5 mmol/L |
10 mmol/L dNTP | 4 | 0.5×n | 200 μmol/L |
10 μM上游引物 | 5 | 1×n | 0.4 μmol/L |
10 μM下游引物 | 6 | 1广西壮族自治区人口和计划生育管理办法×n | 0.4 μmol/L |
DNA Taq聚合酶 | 7 | 0.2×n | 1 U |
| | | |
（2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 μL反应混合液，再加1 μL模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。
（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：
94℃ 4 min (预变性) 94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 2 min 72℃ 7 min
35个循环
（4）注意事项
由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。
a. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。
b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。
c. 每加一种反应物，应换新的头。
3．PCR产物的检测：
琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5 μl / 100 ml TBE）
（1）制胶（以150 mL为例）
a. 称取1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的TBE缓冲液（pH 8.0），摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。
b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量;
c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；
d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。
（2）点样
a. 将2.0 μl 溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；
b. 每孔点样10.0 μl，蓝样品混合物将沉入点样孔下部。
（3）电泳
打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。
西华大学图书馆（4）染
将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染15-20分钟。
（5）观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
（6）注意事项
a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。
b. 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。
c. 倒胶注意厚度（4-6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。
d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。
e. 一般情况下不必每点一个样品都换头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。
思考题：
1． PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？
2． 为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？
3． 用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？
实验三 植物总RNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法
二、实验原理
RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
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