吴启家, 黄林 and 张翼
Citation: 中国科学C辑: 生命科学 3939, 78 (2009); doi: 10.1360/zc2009-39-1-78
View online: engine.scichina/doi/10.1360/zc2009-39-1-78
View Table of Contents: engine.scichina/publisher/scp/journal/SCI SIN Vitae C/39/1 Published by the 《中国科学》杂志社
Articles you may be interested in
超临界状态计算RNA组学: 非编码RNA结构识别与功能预测
SCIENTIA SINICA Vitae 4040, 294 (2010);
甲烷无氧芳构化制芳烃双功能催化剂的研究*
Science in China Series B-Chemistry (in Chinese) 3030, 217 (2000);
《功能与智能材料——结构演化与结构分析》
Chinese Science Bulletin 4747, 980 (2002);
蛋白質的结构与功能
Chinese Science Bulletin 1111, 460 (1960);
Ni-V(镍-钒)催化剂结构的EXAFS研究
Chinese Science Bulletin 3535, 435 (1990);
中国科学C辑：生命科学 2009年 第39卷 第1期: 78~90 www.scichina life.scichina 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS
昂达v711催化RNA的结构与功能
吴启家, 黄林, 张翼
武汉大学生命科学学院, 病毒学国家重点实验室, 武汉 430072
E-mail: wuqijia@126五常论坛
收稿日期: 2008-10-21; 接受日期: 2008-12-25
国家自然科学基金(批准号: 30330170)和国家重点基础研究发展计划(批准号: 2005CB724604)资助项目
摘要在核酶被发现以前, RNA就因为可以像蛋白质一样折叠成高度有序的结构而被预测可能具有催化的功能. 该猜想在20世纪80年代得到了证明, 四膜虫的Ⅰ型内含子RNA与负责tRNA成熟的核糖核酸酶RNase P的 RNA组分被发现具有催化功能. 近年来, 在核酶的结构和功能研究方面取得了很大进展, 包括核糖体在内的多个核酶的高分辨率晶体结构被解析出来. 本文介绍了这方面的最新研究成果. 关键词核酶 结构
催化
在核酶被发现以前, RNA分子因被发现可以像蛋白质一样形成高度有序的二级结构而被认为其可能具有催化活性. 此假设在20世纪80年代, 因Tetrahymena Ⅰ型内含子和RNase P核酶的发现得到了完全的证实[1,2]. 核酶(ribonucleic acid enzyme, 简称ribozyme), 用来指代那些具有催化活性的RNA分子, 它与酶(enzyme), 即具有催化功能的蛋白质分子相应而生. 在过去近30年中, 有十几种核酶被发现. 根据一级序列的大小不同, 核酶可以被分成小核酶和大核酶. 小核酶包括锤头核酶、发卡核酶、VS (varkud satellite)核酶以及HDV(hepatitis delta virus)核酶, 它们的序列长度都在200个核苷酸以下. RNase P,Ⅰ型
内含子, Ⅱ型内含子以及核糖体属于大核酶, 它们的序列长度从几百到几千核苷酸不等. 而根据其催化的反应的不同, 核酶可以被分成4类: 核苷水解核酶(nucleolytic ribozyme), 它们催化的是位点特异性的切割反应; Ⅰ型内含子和Ⅱ型内含子催化的都是两步连续的转酯反应, 可以被归为一类; RNase P在加工tRNA成熟时使用的是一个水解反应; 催化肽转移反应的核糖体是最后一类. 核酶在自然界中广泛存在, 在三界生物中都被发现并参与多种多样的生物学反应. 小核酶主要存在于病毒、类病毒和微卫星的RNA基因组中, 加工滚环复制获得的中间产物到基因组长度[3]. Ⅰ型和Ⅱ型内含子在低等真核生物和植物的细胞器基因组中富集存在[4], 它们的准确剪接对其宿主基因所编码的RNA的成熟至关重要[5,6]. 目前为止, 发现两类核酶在三界生物中普遍存在, 起看家功能. 一类是负责加工tRNA成熟的核糖核酸酶RNase P(ribonuclease P)，它由蛋白质和RNA共同组成, 但其催化功能由RNA 组分独立完成, 因此称为RNase P核酶[7]. 另外, 在生物体最重要的生物学过程——多肽的合成中, 肽键的形成是由核糖体RNA的肽酰转移酶活性催化的, 这意味着核糖体也是一个核酶[8].
在过去的26年中, 科研人员在揭示核酶如何行使酶的功能这一基本的问题上进行了不懈的努力. 在研究核酶的精细结构方面, 核磁共振(NMR)和结晶是两个基本的手段. 直到1994年, 即核酶被发现10年之后, 第1个原子水平的核酶结构(锤头核酶)才被发现[9]. 从那时起, 特别在最近几年, 在研究核酶催化的结构基础方面取得了巨大的进展. 几乎所
78
Downloaded to IP: 192.168.0.24 On: 2019-01-01 03:38:40 engine.scichina/doi/10.1360/zc2009-39-1-78
中国科学C辑: 生命科学 2009年第39卷第1期
有类型核酶的晶体结构都已被解析, 而核糖体的高分辨率的晶体结构也为其RNA催化的结构机制提供了直接的证据. 这些晶体结构成功地揭示了核酶催化的结构基础: 虽然不同种属核酶的一级序列及其三级结构是非常不同的, 但是它们的催化大都采用了广义酸碱的催化机制. 本文将讨论在探索核酶高级结构, 以及核酶结构与功能之间关系的研究进展, 也涉及部分核酶在抗病毒方面的应用. 1核苷水解核酶
1.1核苷水解核酶的催化
核苷水解核酶催化位点特异性的切割反应将滚环复制的中间产物进行加工成基因组长度. 该切割反应是一个转酯反应, 切割位点处的2′-羟基攻击其相邻的3′磷酸, 在3′末端形成一个2′, 3′环化磷酸, 并在其5′-末端形成一个自由的羟基[3]. 该催化反应的化学本质是一个S n2反应(图1(E)). 首先切割位
图1 小核苷水解核酶的结构、活性中心及其催化机制
(A)~(C) 核苷水解核酶的结构和活性中心. 二级结构示意图中各结构域的灰度与三级结构保持一致, 核酶的切割位点用箭头表示(左栏). 三级结构是根据已发表的晶体结构, 用pyMOL软件(0.99)重建(中间栏). 活性中心的原子水平视图是从相应的晶体结构中摘出独立显示(右栏). (A) 垂头核酶, 其三级结构根据PDB文件2GOZ重建; (B) 发卡核酶, 其三级结构根据PDB文件1M5K重建. 双向虚线箭头表示这些碱基参与形成核糖拉链; (C) HDV核酶, 三级结构是根据一个C75U突变的核酶的晶体结构(PDB文件1SJ3)重建; (D) VS核酶的二级结构, 环Ⅰ和环Ⅴ之间的远距配对用虚线标注; (E) 核苷水解核酶的催化机制, A示广义酸; B示广义碱. 双面三棱锥的中间态中4个共平面的原
子用灰填充(a.whu.edu/pictures/sup4review.htm)
79
Downloaded to IP: 192.168.0.24 On: 2019-01-01 03:38:40 engine.scichina/doi/10.1360/zc2009-39-1-78
吴启家等: 催化RNA的结构与功能
聚醚多元醇点处的2′羟基被去质子化, 形成的2′-氧负离子与临近的3′磷原子形成一个较弱的键, 切割位点处形成一
个三棱锥式的中间态, 其中2′-氧负离子亲核试剂和5′-离去基团位于三棱锥的两个顶端, 与3′磷酸处在一条直线上(in-line). 该反应结束后, 切割位点处的3′, 5′磷酸二酯键被打断, 2′-氧负离子与3′磷酸之间则形成共价键连接[10,11]. 总体而言, 这些核酶也可以催化这个切割反应的逆反应——连接反应, 利用5′-羟基作为亲核攻击基团对环化的磷酸进行攻击.
该切割反应是一个广义酸碱反应, 其中需要一个广义碱对2′-羟基进行去质子化以激活2′-氧负离子, 以及一个广义酸对离去基团5′-氧原子进行质子化. 核苷水解核酶之所以这样命名是因为在它们的反应中, 广义酸和广义碱都是核苷, 但HDV核酶例外, 它可能使用了一个金属离子作为广义酸或者广义碱[12].
广义的酸碱反应是核酶的一个普遍机制. 与其他核酶相比, 小核酶的广义酸碱反应有两个独特之处. 其中最大的不同在于它们利用与被攻击的敏感磷原子处在同一个核苷酸中的基团作为亲核攻击基团, 而不是与切割位点很远的碱基(Ⅱ型内含子)或者外源的分子(Ⅰ型内含子、RNase P和核糖体). 另一个不同在于, 这类核酶使用自身的基团作为广义酸和广义碱, 而其他核酶则使用金属离子作为广义酸和广义碱.
1.2小核苷水解核酶的结构特征以及活性中心的组成
虽然核苷水解核酶具有不相关的一级序列和三级结构, 它们都需要形成紧密的折叠, 将起功能的核苷酸带到切割位点附近, 从而充当广义碱或广义酸, 激活亲核攻击基团或稳定离去基团.
(1) 锤头核酶. 锤头核酶是一类具有自我切割活性的RNA, 广泛存在于植物类病毒和寄生虫中, 在滚环复制中催化特定的磷酸二酯键异构化反应. 锤头核酶由1个保守的核心和3个组装成“锤头”形状的颈区组成. 锤头核酶是第一个得到原子水平分辨率结构的核酶, 该晶体结构显示它的茎区Ⅱ和Ⅱ共轴堆积在一起, 而茎区Ⅰ则与茎区Ⅱ形成一个锐角[9] (图1(A)左图). 但从该晶体结构中推断出的结构信息与生化数据在很多方面不相吻合, 其中最大的问题在于该晶体中切割位点处敏感磷原子的定位完全不能满足“in-line”的催化机制[13]. 所以该晶体结构被认为没有反映核酶的活性结构, 而是反映了一个本底状态(ground state). 这个猜想在2006年由一个全长的核酶晶体结构得到了完全的证实[14](图1(A)中图). 在这个晶体结构中, 茎区Ⅱ和Ⅲ连接区域序列戊糖骨架的扭曲使切割位点的核苷酸C17堆积到茎区Ⅲ上, 将其置于三茎区连接区域的活性中心内. 碱基G5与C17的呋喃糖形成氢键, 帮助其定位到适合“in-line”攻击的位点. G12处在可与C17的2′-氧负离子形成氢键的距离内, 而G8则与离去基团5′-氧原子形成氢键, 暗示这两个碱基分别充当广义碱和广义酸. C3与G8形成Watson-Crick碱基配对, 以帮助其定位, 如图1(A)右图所示. 这个全长核酶的晶体结构解决了以前晶体结构与生化数据的主要冲突[15].
(2) 发卡核酶. 发卡核酶与锤头核酶类似, 也是在植物病毒卫星RNA中发现的, 它可以催化一个可逆的自我切割反应来加工滚环复制的产物. 发卡核酶由4个形成四向连接的茎区组成, 分别是茎区A, B, C和D(图1(B)左图). 茎区A和B各包含一个内环, 核酶的切割位点位于茎区A的内环中. 这两个内环中的序列是高度保守的, 而这4个茎区的序列则是高度可变的, 它们的唯一限制就是保持碱基配对[16]. 在核酶的
活性结构中, 茎区A和D共轴堆积在一起, 而茎区B 和C也是共轴堆积在一起(图1(B)中图). 这两个共轴堆积的结构域反向平行排列, 以使茎区A和B的内环相互作用形成核酶的催化中心. 核酶的催化中心涉及茎区A中A10, G11与茎区B中A24, C25, 形成的一个复杂的核糖拉链. 以此+1位的鸟苷酸被挤出A内环并插入到B内环中, 与C25形成一个Watson-Crick碱基配对. 这个作用改变了核糖骨架的构象, 使得−1位腺苷的2′-氧负离子的定位非常利于亲核攻击. G8和A38并排在核酶的催化中心并与敏感磷原子形成氢键, 说明它们可能分别充当催化中的广义碱和广义酸[17](图1(B)右图).
(3) VS核酶. VS核酶在Neurospora线粒体中非常丰富, 在加工复制中间体中起作用. VS核酶长度约为150 nt, 由6个茎区组成, 这6个茎区形成两个三向连接: 2-3-6连接和3-4-5连接, 如图1(D)所示. 茎
新贸易保护主义80
Downloaded to IP: 192.168.0.24 On: 2019-01-01 03:38:40 engine.scichina/doi/10.1360/zc2009-39-1-78
中国科学C辑: 生命科学 2009年第39卷第1期
区Ⅰ的内环中包含了核酶的切割位点, 茎区Ⅳ, Ⅲ和Ⅵ共轴堆积在一起, 形成一个长的柱状结构; 茎区Ⅱ和Ⅴ从这个柱中发散出来. 核酶的连接区域的序列对核酶茎区的共轴堆积至关重要[18]. 核酶的催化中心位
于茎区Ⅵ的A730内环中, 而核酶的切割位点位于茎区Ⅰ内环中G620之后. 茎区Ⅰ末端环中的GUC 3碱基可以与茎区V末端环的GAC形成远距配对[19], 这个相互作用将核酶的切割位点带到了催化中心处. 由于VS核酶到现在还没有高分辨率的晶体结构, 所以对比其与发卡核酶的相似性, 加上生化数据显示, A765和G638可能参与了核酶的广义酸碱催化, 但目前还不清楚究竟哪个碱基充当广义碱[20]. G620和A638A之间的“sheared base pair”以及G638同时与A621, A622形成的共享的“sheared base pairs”帮助将待去质子化的2′羟基定位到广义碱附近[21].
(4) HDV核酶. HDV是乙肝病毒(HBV)的一个卫星病毒, 它具有一个长约1700个碱基的环形单链RNA基因组, 其中70%是自身互补的. 由RNA聚合酶Ⅱ驱动的复制产生基因组RNA和反基因组RNA串联体, 两种RNA都编码HDV核酶以将串联体复制产物切割成基因组长度的单元. HDV核酶由5个配对区组成, 分别是P1~P4以及一个2 bp的配对P1.1. 这些配对区形成一个复杂的双交叉的假节: P1和P2形成一个假节, P3和P1.1形成另一个假节, 这两个假节交叉使P1和P1.1之间形成第3个假节. 这5个配对区被组装成两个平行的结构域, 其中P1, P1.1和P4共轴堆积在一起, P2和P3共轴堆积在一起(图1(C)). 这两个结构域并排排列, 通过5个交叉链连接, 并进一步被
落雪梨花
P1.1固定[22]. 配对区P1是包含切割位点的底物配对区. 核酶的活性中心包括P1.1, P3和连接区域, 而配对区P1, P2和P4仅仅是稳定活性中心的结构元件[23]. HDV核酶的催化需要二价金属离子, 二价金属离子可能直接参与核酶的催化. 核酶催化的另一个至关重要的因子是C75(U75). 这两个因子可能在催化中
充当广义酸和广义碱, 但哪一个充当广义碱到目前为止还不清楚(图1(C)右图). HDV核酶的第一个晶体结构显示C75与离去基团十分靠近, 说明它可能充当了广义酸[23]. 后来的多条生化证据支持C75作为广义酸的机制[24]以及一个水化的金属离子作为广义碱[12]. 但是最近的一个晶体结构显示C75与亲核攻击基团靠得非常近, 暗示它可能充当广义碱, 而水化的金属离子充当广义酸[25]. 所以还需要进一步的研究来区分这两个因子的具体作用.
2 RNase P核酶
RNase P是一个由单个RNA与一个或多个蛋白构成的复合体. 复合体中的RNA组分是其催化亚基, 所以RNase P也是一个核酶.RNase P在三界生物, 包括古细菌、细菌和真核生物中广泛分布, 在多种RNA 的成熟中起作用. 与其他核酶相比, RNase P有一些独特的性质. 首先, RNase P核酶是以反式方式作用的, 并可以催化多轮反应. 此外, 与其他核酶只能切割自身所在的RNA不同, RNase P可以加工多种底物, 例如所有的tRNA, 4.5S rRNA和tmRNA(tRNA- like和mRNA-like RNA).
2.1 RNase P核酶的催化
RNase P使用一个水解反应来加工tRNA的成熟. 该反应的化学本质也是一个广义酸碱反应. 虽然该核酶已经有几个晶体结构, 但其功能基团在原子水平上的排列还没有被得到, 所以该反应的机制大部分是从生化数据中推断得来的. 反应中的亲核攻击基团被推断是一个被广义碱激活的水分子. 该反应需要3个
二价金属离子参与(图2(B)). 离子A作为广义碱对水分子进行去质子化, 形成一个水化的金属离子作为亲核攻击基团起始反应. 离子B在稳定三棱锥中间态中起作用. 前体tRNA切割位点处(N−1)处的2′羟基通过一个水分子结合第3个金属离子C完成对3′离去基团的质子化[7].
2.2 RNase P核酶的结构以及活性中心
RNase P核酶的一级序列和二级结构是非常多样的, 但所有的核酶都具有一系列高度保守的结构元件来组成核心结构. 核酶的核心结构包括5个包含高度保守序列的保守区(conserved region, CR), 分别为CRI-CRV(图2(A)左图). 除了这些共同的核心结构外, 每一个RNase P核酶都具有其独特的周边结构, 这些周边结构在每界生物中是进化上保守的. 细菌的RNase P长度约330~400 nt, 根据其具有的周边结构可以被分成两个亚类: A-type(Ancestral)和B-type
81
Downloaded to IP: 192.168.0.24 On: 2019-01-01 03:38:40 engine.scichina/doi/10.1360/zc2009-39-1-78
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议