“酶”处理染质免疫沉淀（琼脂糖微球式）操作方法
所需试剂
包含在试剂盒 SimpleChIP™ Enzymatic Chromatin IP Kit （Agarose Beads） #9002中的试剂：
a.甘氨酸溶液（10X）
b.缓冲液A（4X）
c.缓冲液B（4X）
d.ChIP缓冲液（10X）
e.ChIP洗脱（缓冲）液（2X）
f.5 M NaCl
g.0.5 M EDTA
h.1M DTT
i.DNA结合（缓冲）液
j.DNA漂洗（缓冲）液
k.DNA洗脱（缓冲）液
l.DNA纯化柱
m.蛋白酶混合抑制剂（200X）
n.核糖核酸酶A（10 mg/ml）
o.微球菌核酸酶（2000 gel units/μl）：NEB #M0247S
p.蛋白酶K（20 mg/ml）：NEB #P8102S
q.人对照基因RPL30外显子3引物
r.小鼠对照基因RPL30内含子2引物
s.组蛋白H3（D2B12）XP™兔单抗（ChIP专用） #4620
t.正常兔IgG #2729
u.ChIP级蛋白G琼脂糖微球 #9007
不包含在试剂盒SimpleChIP™ Enzymatic Chromatin IP Kit （Agarose Beads） #9002中的试剂：
a.PMSF （0.1 M，溶剂乙醇）
b.37%的甲醛溶液
c.乙醇（96-100%）
d.1X PBS
e.无核酸酶的水
f.Taq DNA聚合酶
g.dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）混合液
开始之前：
每次实验需要刺激或处理大约4X 107个细胞。这些细胞中提取的染质可以用于多达10次单独的免疫沉淀实验。
∙以Hela细胞为例，这相当于5个15 cm培养皿中细胞密度达到90%时的总细胞数（一般每个盘中的培养基为20 ml）。
∙另外准备一盘细胞用于血球计数板法测定细胞数。
取出并需预热的试剂：
∙200X蛋白酶混合抑制剂
∙1 M的二硫苏糖醇
∙0.1 M PMSF （自备）
∙10X ChIP缓冲液（使用前请确认SDS已完全溶解）。
为每4 X 107细胞准备以下试剂，并在冰上预冷（5个培养皿）：
∙ 10 ml 10X 甘氨酸溶液
∙ 200 ml 1X PBS（自备）
∙ 10 ml 1X PBS + 100 μl PMSF
∙ 10 ml 1X孙睿小说 缓冲液 A （2.5 ml 4X缓冲液 A + 7.5 ml 水） + 5 µl 1 M DTT + 50 µl 200X 蛋白酶混合抑制剂l （PIC） + 100 µl PMSF
∙ 11 ml 1X 缓冲液 B （2.75 ml 4X 缓冲液 B + 8.25 ml 水） + 5.5 µl 1 M DTT
∙ 1 ml 1X ChIP 缓冲液 （100 µl 10X ChIP 咖啡季节缓冲液 + 900 µl 水） + 5 µl 200X 蛋白酶混合抑制剂 （PIC） + 10 µl PMSF.
1.为了使蛋白与DNA交联，向每个含有20 ml培养基的15cm培养皿中加入540 µl 37%的甲醛溶液。稍加转动培养皿使之混匀，室温放置10分钟。
o甲醛的终浓度为 1%.
o使用新鲜未过产品保质期的甲醛溶液
o加入甲醛后，培养基的颜会发生改变。
2.每个盘中加入2 ml 10X 甘氨酸溶液稍加转动使之混匀，室温孵育5分钟。
o加入甘氨酸后，培养基的颜会发生改变。
3.对于贴壁细胞，弃去培养基后用冰冷的PBS漂洗两次（20 ml /次），彻底弃净PBS。对于悬浮细胞，4℃1500rpm离心5分钟，沉淀用冰冷的PBS漂洗两次。
4.每盘细胞中加入2 ml冰冷的1X PBS + PMSF，将细胞刮下并将5盘细胞收集到一个15 ml的锥底管中。悬浮细胞直接将细胞重悬到2 ml的冰冷缓冲液中合并即可。
5.4°C 1500rpm离心5分钟。弃上清，并将细胞重悬在10 ml冰冷缓冲液 A + DTT + PIC + PMSF中。冰上孵育10分钟。每3分钟颠倒混匀一次。
6.4°C 3000rpm离心5分钟以沉淀细胞核。弃上清，并将沉淀重悬在10 ml冰冷的缓冲液B + DTT中。再次离心，弃上清，并将沉淀重悬在1.0 ml 缓冲液 B + DTT中。将样品转移到1.5 ml离心管中。 7.加入5 µl微球菌核酸酶，颠倒混匀数次，37°C孵育20 min，每隔3~5分钟颠倒混匀一次，将DNA消化成长度约为150-900 bp的片段。
o需要做预实验确定将不同细胞系DNA酶切到理想长度所需微球菌核酸酶的酶量（参照附录A）。
o4 X 107个HeLa细胞核用5 µl微球菌核酸酶在1 ml缓冲液 B + DTT中消化可以得到合适长度的DNA片段。
8.加入100 µl 0.5 M EDTA终止消化，将离心管置于冰上。
9.4°C 13000rpm离心1分钟，沉淀细胞核。弃上清。
10.将细胞核沉淀重悬在1 ml 1X ChIP 缓冲液 + PIC + PMSF中，然后将样品一分为二，向两个离心管各分装500 µl。冰上孵育10分钟。
11.对每管细胞核样品用超声波处理数次以破碎核膜。在每次超声处理操作之间，将样品在冰上孵育30秒。
o可以在超声前后利用光学显微镜观察细胞核以判断完全破碎细胞核所需的最佳条件。
o利用VirTis Virsonic 100超声破碎仪，设置模式6，1/8英寸的探头，对Hela细胞核进行每次20秒，共3次的超声处理可以达到完全破碎的效果。
o或者也可以用杜恩斯型匀浆器处理细胞核20次，但是这种破碎效果可能不如超声处理完全。
12.4°C 10000rpm离心10分钟，使样品澄清。
13.将上清转移到一个新管子中，即为交联的染质样品。在下一步使用之前需要保存在-80°C。取50 µl用以分析DNA的酶切情况并确定其浓度（参照B部分）。
B. 分析染质的浓度和酶切情况（推荐步骤）
1.向50 µl的染质样品中（来自A部分第13步）加100 μl无核酸酶的水，6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋震荡混匀， 37°C孵育30分钟。
2.向RNAse A消化后的样品中加入2 μl 蛋白酶K。涡旋震荡混匀， 65°C孵育2小时。
3.按照F部分的说明利用离心柱纯化DNA。
4.DNA样品纯化后，取10 µl与1 kb DNA Marker进行1%琼脂糖凝胶电泳以确定DNA片段大小。DNA应当被酶切成长度约为150-900 bp的片段（1~5个核小体长度）
5.测产出缺口定DNA浓度时，将2 µl纯化后的DNA加入到98 µl TE缓冲液中（即稀释50倍），然后读取OD260吸收值。将OD260乘以2500即得到以μg/ml表示的DNA浓度。理想的DNA浓度应
当在100~200 μg/ml之间。
注意：要得到理想的ChIP结果，合适长度和浓度的染质样品至关重要。过度消化可能会减弱PCR定量信号。而消化不足可能会导致过高的背景信号并降低分辨率。加入到IP体系中的染质太少也可能导致不能产生PCR定量信号。优化染质消化条件的操作方法请参照附录A。
C. 染质免疫沉淀
开始之前：
从冰箱中取出并预热：
∙200 X 蛋白酶混合抑制剂
∙交联的染质样品（来自A部分第13步）
∙10 X ChIP 缓冲液（使用前请确认SDS已完全溶解）
从冰箱中取出并置于冰上
∙ChIP级的G蛋白琼脂糖微球 #9007
∙免疫沉淀所用的抗体，包括阳性对照组蛋白H3 （D2B12） XP™ 兔单抗 （ChIP专用） #4620，和阴性对照抗体正常兔IgG #2729。
注意：交联的染质样品也可以不按照下面的描述稀释，将抗体直接添加到未稀释的染质样品中沉淀染质复合物。
1.在一个样品管中先为所需的免疫沉淀反应准备足够的1 X ChIP缓冲液。每个沉淀反应需要400 μl 1 X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP缓冲液 韦氏测试+ 360 µl水）和2 µl的蛋白酶混合抑制剂。在确定免疫反应数时，应当包括阳性对照组蛋白H3 （D2B12） XP™ 兔单抗 （ChIP专用） #4620和阴性对照抗体正常兔IgG #2729样品。混匀后置于冰上。
2.在配好的ChIP缓冲液中，每反应加入100μl交联后的染质样品（10~20ug的染质DNA，来自A部分第13步）。例如， 10个免疫沉淀反应就需要准备一个含有4 ml 1 X ChIP 缓冲液的离心管（400 µl 10 X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 μl 蛋白酶混合抑制剂 + 1 ml 消化后的染质样品。
3.吸取10 µl稀释后的样品并转移到一个微量离心管中。这就是2%样品输入对照，使用之前可以保存在-20°C （用于E部分的第一步）。
4.分装每个免疫沉淀反应所需要的500 µl稀释的染体样品到各个离心管中并加入对应的抗体。每种抗体做免疫沉淀时所需用量有差异，需要用户在使用时加以调整。对于阳性对照组蛋白H3 （D2B12） XP™ 兔单抗 （ChIP专用） #4620，加入10 µl即可。对于阴性对照正常兔IgG #2729，需加1 µl （1 µg）~5 µl（5 µg）。在4°C的转子上孵育4小时以上或过夜。
5.加入30 μl的ChIP级的蛋白G怎样学好化学琼脂糖微球 #9007，在4°C的转子上孵育2小时。
6.开始D部分操作。
D. 漂洗免疫沉淀的染质：
开始之前：
从冰箱中取出并预热：
∙10X ChIPDML 缓冲液并确认SDS已完全溶解
为每个免疫沉淀反应准备并在冰上预冷：
∙低盐漂洗液: 3 ml 1 X ChIP缓冲液 （300 µl 10 X ChIP缓冲液 + 2.7 ml水）
∙高盐漂洗液: 1 ml 1 X ChIP 缓冲液（100 µl 10 X ChIP 缓冲液 + 900 µl 水） + 70 µl 5M NaCl
1.4°C 6000rpm，离心1分钟，沉淀每个样品（来自C部分第5步）中的蛋白G琼脂糖微球，并除去上清。
2.加入1 ml低盐漂洗液重悬微球，在4°C转子上孵育5分钟。再重复第1步和第2步两次，即总共用低盐漂洗液洗三次。
3.加入1 ml高盐漂洗液重悬微球，在4°C转子上孵育5分钟。立即进入E部分第二步。
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