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UNICORN TM 6软件控制的A ..
KTA TM avant25系统，用于研发单克隆抗体（MAb ）纯化的两步谱工艺过程。MabSelectSuRe TM ，基于蛋白A 的谱柱料（合成树脂），用来进行初始的捕获步骤；而多模式阴离子交换剂Capto TM adhere ，用来进行第二步精制步骤，减少不纯物。实验设计在精制步骤用来筛选上样条件。样品的pH 、电导率和上样量有所变化。使用1毫升预装的HiTrap TM 柱子，设计运行时间少于24小时，简化的设计实施确立了工艺过程条件的稳健性。将功能性整合在UNICORN TM 6软件的实验设计（DoE ），与HiScreen TM 一起使用，在大约一周的时间内将所有的工艺过程进行了优化。尽管料液研究具有挑战性，靶MAb 的高产率和纯度都达到了目的。 前言
在生物药物复合物纯化工艺过程研发中，时间和灵活性是重要条件。A ..
KTA TM avant25是一款专门为全自动工艺过程研发而设计的谱系统，使用刚性谱柱料。功能性整合在UNICORN TM 6软件的实验设计（DoE ），增强了产率。实验设计（图1）有利于简便快速的工艺过程研发，是工艺过程研发实验室优化谱条件、增加通量的有力工具。在单克隆抗体（MAb ）纯
化过程中，蛋白A 是捕获步骤选择的谱柱料，基于它的高分离性产生良好的纯度，无论大规模和小规模都可以方便地使用。因此，蛋白A 为基础的柱料是进行MAb 纯化的平台方法的根基。
图1嵌入实验设计功能的UNICORN6软件，为简便快速的工艺过程研发而设计。在实验功能设计中，多因子同时变化，结果数据用来生成统计模型。模型经过验证后，用来产生系统图为判定提供帮助。
接着，下游的数据处理可以根据不同谱技术应用指南28-9573-47AA 谱系统
使用A ..
KTA TM
avant25进行MAb 纯化的快速工艺过程研发
模型评价使用模型进行预测和判定输入设计
和技术的组合进行（尤其离子交换和疏水相互作用谱）。一种新的MAb 纯化方法，包括两步流程（图2），凭借多模式层析柱料，能进行阴离子交换和其它的相互作用类型，确保同时选择性去除抗体的二聚体和聚合物（D/A ）、去除宿主细胞蛋白（HCP ）、DNA 和病毒（1，2）。为了充分发挥多模式层析柱料的良好特性，需要进行全面的纯化过程的优化。
图2经典的三步抗体纯化策略，应用MabSelectSuRe,SPSepharos e TM FastFlow，和Captoadhere(左边的箭头)；基于MabSelectSuRe 和Captoadhere(中间的箭头)的两步策略；用于精制步骤的另外的Capto 柱料三步策略(右边的箭头)。
考试周刊下面的步骤（总结在表1）是使用UNICORN6控制
的A ..
KTAavant25进行MAb 纯化的研发方法：（1）起始的亲和谱步骤，通过pH 洗脱实验决定洗脱MAb 合适的pH 范围；（2）分析判定动态结合载量；（3）从料液中纯化MAb ；（4）纯化方法规模放大，为精制步骤准备材料；（5）纯化抗体池用来研究精制步骤的上样条件；（6）使用实验设计进行参数筛选；（7）使用实验设计进行稳健性研究。
材料和方法
柱子、设备和MAb 纯化
为了纯化M A b ，U N I C O R N 6软件用来控制
A ..
KTAavant25系统，该系统配置两个样品进样阀，可
以自动上样和清洗。使用A ..
KTAavant25的压力/流量调控特性，确保在样品上样过程中没有多余的压力。本质上讲，应用MabSelectSuRe 进行的所有亲和谱，以及应用Captoadhere 进行的所有离子交换，都可以使用相同的方法。装有MabSelectSuRe 和Captoadhere 的HiTrap(1毫升)和HiScreen(4.7毫升)预装柱，用来进行不同的实验步骤（表1）。为了优化精制步骤，装有MabSelectSuRe 的XK50/20柱子用来纯化材料。
筛选Captoadhere 上样条件的实验设计
已知电导率、pH 和样品上样量是Captoadhere 样品上样的重要参数（1）。设计一种实验设置可以同时检测许多不同的条件（因子）。使用实验设计（DoE ），可以较好的达到这个目的，实验设计利用统计学辨认和定义对于工艺过程/产品有最重要影响的因子。为了获得最大的信息，认真选择设计数套实验，其中所有的相关因子不同而且同时被评估。在方法优化中，使用实验设计极大的增加了真实的最佳纯化确立的可能性。
在这个研究中，包含在UNICORN6中的完全因子实验设计（DoE ），用来进行Captoadhere 样品上样
条件的筛选（参见表1步骤6）。该完全因子实验设计含有三个参数（样品上样量、电导率和pH ），就是23=8个实验和三个中心点，总共11个实验（表2）。中心点对应192毫克/毫升柱料的上样量，电导率20mS/cm ，以及pH6.75。起始材料的浓度在每毫升10.8和11.7毫克MAb 之间变动，宿主细胞蛋白在平均45ppm ，蛋白A 在2ppm ，以及二聚体和聚合物在1.9%。
细胞培养 细胞去除 病毒灭活
病毒过滤 SPSepharoseFastFlow/CaptoS
CaptoQ* Captoadhere
Captoadhere
最终过滤、超滤/渗滤池
无菌过滤
*WO2004/076485
表1不同柱子和使用条件的总结 步骤编号 描述和目的
柱子
缓冲液
1 MabSelectSuRe 的洗脱pH 的判定 HiScreenMabSelectSuRe 20mM 柠檬酸盐，pH6.0到3.0
2 MabSelectSuRe 的动态结合载量的判定 HiTrapMabSelectSuRe PBS ，pH7.4和柠檬酸盐，pH3.5
3 MabSelectSuRe 的MAb 的纯化
HiScreenMabSelectSuRe PBS ，pH7.4和柠檬酸盐，pH3.5 4 Captoadhere 精制步骤的材料制备(规模放大) 装有MabSelectSuRe 的XK PBS ，pH7.4和柠檬酸盐，pH3.5
50/20柱子(柱床高度=8.4
厘米,Vc=165毫升) 5 Captoadhere 上样条件的判定
HiScreenCaptoadhere 20mM 磷酸钠，20mM 柠檬酸盐，pH7.8到4.0 6 Captoadhere 上样条件筛选的实验设计(DoE) HiTrapCaptoadhere 20mM 磷酸钠，20mM 柠檬酸盐，pH7.5,6.75，和6.0
7
Captoadhere 的稳健性研究
HiTrapCaptoadhere
50mM 磷酸钠，pH6.95，6.75和6.55
MAb 的洗脱性能定义为由峰顶点的pH 决定（近似5.79），在这样的设计中一般用来定义pH 的下限。然而，在这个例子中，在低pH 值和低电导率（小于10mS/cm ）时，样品发生了沉淀。由于这个原因，设计中pH 的下限设置为pH6.0，而电导率维持在大于等于10mS/cm 。设计中pH 的上限通常选择为比洗脱pH 高2个pH ，在这个例子中为7.5。电导率在10至30mS/cm 之间变化，上样量在100到300毫克MAb/毫升柱料之间。
Captoadhere 的稳健性研究
稳健性研究在实验设计筛选确立的条件下进行，使用此条件范围内不同的pH 、电导率和上样量。此外，还包括两种不同的料液，以及两种不同货号的柱料。两种料液都比实验设计筛选使用的料液污染程度更高。简化的设计有五个参数，即设置了8个实验和3个中心点，总共11个实验（表3）。两个料液的起始材料浓度在12.7和14.7毫克MAb/毫升之间变化，两个料液的宿主细胞蛋白是80ppm 。料液1的蛋白A 是3ppm ，料液
表2为了筛选上样条件和筛选结果，实验设计（DoE ）的设计布局
实验设计编号 运行次序编号 上样量 上样电导率
上样pH
回收率（%） 宿主细胞蛋白 蛋白A(ppm)
二聚体和 （毫克/毫升柱料） （mS/cm ） （ppm ）
聚合物(%)
DOE1 8 100 10 6.0 82.3
9 <1 0.93 DOE2 1 301 10 6.0 98.0 31 <1 0.67 DOE3 10 104 30 6.0 72.6 10 <1 0.65 DOE4 7 312 30 6.0 96.4 16 <1 0.86 DOE5 6 93 10 7.5 49.0 8 <1 0.22 DOE6 3 282 10 7.5 92.9 26 <1 0.65 DOE7 11 102 30 7.5 70.3 10 <1 0.49 DOE8 9 307 30 7.5 93.2 22 <1 1.04 DOE9 5 192 20 6.75 92.2 13 <1 0.86 DOE10 4 192 20 6.75 95.1 13 <1 0.81
DOE11
2
192
20
盐湖城丑闻
6.75
93.4
12
<1
0.69
D
oE5被排除，认为是离值DoE9-11是设计的中心点（上样量192毫克/毫升，电导率20mS/cm ，以及pH6.75）
表3为了上样条件的稳健性研究，以及稳健性研究的结果，（DoE ）的设计布局
实验设 运行次 上样量 上样电导率 上样pH
谱柱 样品供给
回收率 宿主细胞蛋白 蛋白A 二聚体和 计编号 序编号 （毫克/毫升柱料） （mS/cm ）
料批号 （%） （ppm ） （ppm ） 聚合物(%) DOE1 2 190 17 6.55 A Feed 2 86.7 20 <1 2.3 DOE2 9 210 13 6.55 A Feed 1 93.9 55 2 1.2 DOE3 3 190 17 6.95 A Feed 1 76.1 25 <1 1.7 DOE4 10 210 13 6.95 A Feed 2 83.7 55 2 1.5 DOE5 4 190 13 6.55 B Feed 2 86.4 25 <1 2.1 DOE6 5 210 17 6.55 B Feed 1 85.3 55 2 1.3 DOE7 7 190 13 6.95 B Feed 1 78.1 15 <1 1.9 DOE8 6 210 17 6.95 B Feed 2 88.3 25 <1 2.2 DOE9 1 200 15 6.75 A Feed 1 81.9 20 <1 2.5 DOE10 8 200 15 6.75 A Feed 1 85.4 55 1 1.7 DOE11
11
200
15
6.75
范立础A
Feed 1
83.2
25
<1
2.4
DoE9-11是设计的中心点（上样量200毫克/毫升，电导率15mS/cm ，以及pH6.75）
2的是4ppm 。料液1的二聚体和聚合物平均值是5.3%，而料液2的是3%。DoE9-11是设计的中心点（上样量200毫克/毫升柱料，电导率15mS/cm ，pH6.75）。
产量、宿主细胞蛋白清除、聚合物含量和蛋白A 泄露实验的检测回收率和浓度的判定
不仅通过使用消光系数1.49在280纳米测量紫外读数可以测定浓度，使用在A ..
KTAexplorer TM 10谱系统上Hi T rapMabSel e ctSuRe1毫升柱子通过亲和层析谱也可以进行。
二聚体/聚合物分析
使用与A ..
KTAexplorer10系统进行连接的两个互连的Superdex TM 2005/150GL 柱子，通过凝胶过滤（分子筛谱）进行了穿透组分的分析（数据未显示）。每个样品小份进行了柱子上样，在PBS 溶液中以流速0.35毫升/分钟运行15分钟。聚合物含量测定通过280纳米测量紫外和计算峰面积比例进行判定。
武汉十五中张飞跃事件宿主细胞蛋白（HCP ）和配基泄露的分析
宿主细胞蛋白的水平测定，通过使用商业化的抗CHO 宿主细胞蛋白抗体（Cygnus 技术有限公司）进行。实际上，在Gyrolab TM
工作站LIF(GyrosAB，乌普萨拉，瑞典)上使用GyrolabBioaffy TM 20HC 实验室微盘，ELISA 方法学也为大家接受。使用商业化的ELISA 试剂盒（Repligen 公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）的改良操作规程，进行配基泄露（MabSelectSuRe 蛋白A 配基）的测定。
SDS-PAGE 分析
样品使用1M 氢氧化钠调整pH 到8.5。使用二甲基甲酰胺制备CyDye TM DIGE 荧光最小染法染料（Cy5）工作溶液（12.5微升二甲基甲酰胺溶解5nmolCyDye ）。Cy5溶液（1微升）加入到50微克蛋白质中，接着在暗室冰浴孵育30分钟。反应使用1微升10mM 赖氨酸进行终止。未还原的样品（每孔5微克）在Multiphor TM II 平板电泳系统进行分离，使用预制的ExcelGel TM SDS 梯度8–18凝胶。凝胶在Ettan TM DIGE 扫描仪进行扫描。由于MAb 数量和污染物数量的显著不同，扫描过程使用了几个不同的光电倍增管（PMT ）电压。
结果和讨论宫体诗
我们对蛋白A 为基础的捕获步骤，和多模式阴离子交换的精制步骤组成的两步纯化方法进行了研发。使用UNICORN6控制的A ..
KTAavant25系统，工艺过程研发在大约一周的时间内完成。方法研发获得了高纯度MAb 的高回收率。获得的纯度一般认为适合绝大多数性使用，但是也可以使用三步纯化进行提高。
使用的材料具有挑战性，主要由于样品的沉淀，运行第二步必须提高电导率。
低电导率通常会导致更好的污染物去除（1）。随着时间的增加，以及在低pH 和电导率的情况下，另外的挑战是MAb 聚合增加，这样第一次实验使用的样品比后来使用的样品二聚体和聚合物较低，例如，在稳健性研究中。
使用MabSelectSuRe 进行MAb 的捕获
MabSelectSuRe 洗脱pH 和动态结合载量的测定
如图4所示，MAb 洗脱在线性pH 梯度下进行。峰顶点的洗脱pH 值是3.67，10%峰顶点值是3.56（也就是，下降处）。基于这一结果，决定洗脱pH 使用3.5，可以
得到高产量和窄的洗脱峰。在10%拐点（10%DBC ）处，动态结合载量在保留时间2.4分钟和4分钟，分别测定为21和40毫克/毫升。
柱子: HiScreenMabSelectSuRe,4.7ml
样品:
1ml 澄清的CHO 料液，每毫升含有1.72mgMAb 结合缓冲液: 20mM 柠檬酸盐,pH6.0洗脱缓冲液: 20mM 柠檬酸盐,pH3.0
梯度: 线性,10个柱体积的20mM 柠檬酸盐缓冲液pH6.0到3.0流速: 0.5ml/min 系统:
A ..
桐城派散文
KTAavant25
图4HiScreenMabSelectSuRe 的洗脱pH 测定。
MabSelectSuRe 的Mab 纯化
图5显示了HiScreenMabSelectSuR 柱子进行MAb 纯化的谱图，作为例子。回收率达到99%，宿主细胞蛋白为25ppm ，二聚体和聚合物为0.8%，沥滤的蛋白A 为6ppm 。
柱子: HiScreenMabSelectSuRe,4.7ml
样品:
112.5ml 澄清的CHO 料液，每毫升含有1.17mgMAb 结合缓冲液: PBS,pH7.4
洗脱缓冲液: 50mM 柠檬酸盐,pH3.5流速: 1.2ml/min，保留时间4min
梯度:
一步，从结合缓冲液到洗脱缓冲液在位清洗(CIP): 两个柱体积的0.1MNaOH，接触时间15min 系统:
A ..
KTAavant25
图5HiScreenMabSelectSuRe 的MAb 的纯化。穿透之后的第一个峰是纯化的MAb ，第二个峰含有来自CIP 的污染物。pH （红曲线）显著下降的原因是，氢氧化钠上样时，pH 监控器的旁路作用记录的结果，因此，不是纯化过程中此点pH 的真实测量值
。
在Captoadhere 精制步骤之前使用XK50/20柱子进行规模放大
为了精制步骤实验的材料制备，建立的方法应用在XK50/20柱子上进行规模放大（数据未显示）。A ..
KTAexplorer100系统用来进行规模放大。XK50/20纯化的抗体池，接下来用于在Captoadhere 上进行筛选和稳健性运行。与先前的运行相比，在XK50/20规模放大中，宿主细胞蛋白、蛋白A 、二聚体和聚合物的水平较高。
使用Captoadhere 进行精制步骤结合和洗脱条件的初步筛选
3mgMAb 在pH7.8时上样到HiScreenCaptoadhere 柱子上。从pH7.8到4.0进行线性pH 梯度的洗脱。MAb 洗脱在相对宽阔的峰形中进行（图6）。峰顶点的洗脱pH 是5.79。为了进一步优化，洗脱位置定义为设计的pH 下限。然而，由于低pH 和电导率会引起沉淀，设计的pH 下限定为6.0，电导率维持在大于等于10mS/cm 。
柱子: HiScreenCaptoadhere,4.7ml
样品: 来自1mlHiScreenMabSelectSuRe 的洗脱池，
应用起始缓冲液稀释到3mg/ml 起始缓冲液: 20mM 磷酸钠,20mM 柠檬酸盐,pH7.8洗脱缓冲液: 20mM 磷酸钠,20mM 柠檬酸盐,pH4.0梯度: 线性,20mM 磷酸,20mM 柠檬酸盐,
pH7.8–4.0，10倍柱体积流速: 2.4ml/min 系统:
A ..
KTAavant25
图6HiScreenCaptoadhere 上结合和洗脱条件的测定。
使用实验设计进行上样条件的筛选
图7显示了应用HiTrapCaptoadhere 进行筛选设计，产生的代表性典型的穿透谱（MAb 在穿透中洗脱），此设计的数据总结在表2。此谱结果对于应用筛选目的实验设计的中心点具有代表性（表2）。
柱子: HiTrapCaptoadhere,1ml
样品: 来自HiScreenMabSelectSuRe 洗脱池(设计的中心点，也
就是pH6.75，电导率15mS/cm ，上样量200mg/ml 柱料)起始缓冲液: 20mM 磷酸钠,20mM 柠檬酸盐,
pH6.75使用氯化钠将电导率调整为15mS/cm 再生缓冲液: 0.1M 醋酸,pH3.0
梯度: 在起始缓冲液，再生缓冲液和CIP 之间步骤梯度流速: 2.0ml/min CIP: 1MNaOH，接触时间15min 系统: A ..
KTAavant25
图7HiTrapCaptoadhere 筛选设计的谱图。MAb 从穿透液中洗脱，而在大约32毫升和35毫升两个峰是分别来自于CIP 的聚合物和不纯物。
图8总结了实验设计筛选的结果。通过使用“数据模型吻合小结（Summaryoffit ）”、“系数图（Coefficientplot ）”和“等值线图（Contourplots ）”，结果以三种不同的方式进行了可视化展示。分析了三个响应值，回收率、宿主细胞蛋白去除、二聚体和聚合物（D/A ）去除。第四种响应值，蛋白A 泄露太低，无法进行统计学模型的设计。实际上，在来自HiScreenMabSelectSuRe 柱子洗脱组分中观察的蛋白A 泄露，也已经太低。
在Summaryoffit 中，对于回收率和聚合物模型，响应值的百分比偏差，通过模型（R2）>0.8进行解释，显示为良好的模型吻合。对于两个模型的所有因子，模型（Q2>0.5）达到了高预测能力（根据交
互证实的模型，预测响应值的百分比偏差，Q2）。R2大于0.5时，显示为强有力的模型；在大于0.9时，为极佳的模型。对于宿主细胞蛋白去除，获得了中等质量和低有效性的模型。这个模型得到的重复变化测量，重复性是大
于0.5，显示实验过程中误差最小和控制良好。
系数图显示回归系数和置信区间。模型中的重要系数都保留了；如果因子间的相互影响发现显著性，一些无关紧要的系数也予以保留。
等值线图显示两个因子对于特定响应值的效应。正如期望的一样，增加上样量正性影响回收率，而污染物清除率在较低上样量时有所改善
。
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