姚㊀靖１ꎬ２ꎬ吴㊀婷２ꎬ叶世蔚２ꎬ高玉峰２ꎬ郑㊀炜２∗ꎬ秦水介１∗
(１.贵州大学㊀ａ.物理学院ꎻｂ.贵州省光电子技术与应用重点实验室ꎬ贵阳５５００２５ꎻ２.中国科学院深圳先进技术研究院生物医学光学与分子影像研究室ꎬ深圳５１８０５５)
质量管理体系的意义摘㊀要：本文提出利用离轴抛物镜共焦中继系统来改善双光子成像视场边缘像质变差的问题ꎬ进而提升双光
子成像视场ꎮ不同于传统的双胶合透镜扫描中继系统ꎬ离轴抛物镜共焦扫描中继系统由一对离轴抛物镜构成ꎬ扫描振镜位于抛物面镜焦点处ꎮ仿真和试验结果均显示ꎬ该系统能有效优化视场边缘的像散㊁场曲和畸变情况ꎬ提高成像质量ꎮ利用该扫描系统ꎬ我们实现了视场为２.４ｍｍˑ２.４ｍｍꎬ横向分辨率为１μｍ的大视场双光子显微成像ꎬ能清晰分辨小鼠大脑切片中的神经轴突结构ꎮ
关键词：离轴抛物面反射镜ꎻ双光子成像ꎻ共焦扫描中继ꎻ像差ꎻ大视场中图分类号:Ｏ４３５
文献标志码:Ａ
ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００７￣７１４６.２０２０.０３.００４
Ｏｆｆ￣ａｘｉｓＰａｒａｂｏｌｉｃＭｉｒｒｏｒＡｆｏｃａｌＳｃａｎｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍＥｘｔｅｎｄｓｔｈｅ
ＩｍａｇｉｎｇＡｒｅａｏｆＴｗｏ￣ｐｈｏｔｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
ＹＡＯＪｉｎｇ１ꎬ２ꎬＷＵＴｉｎｇ２ꎬＹＥＳｈｉｗｅｉ２ꎬＧＡＯＹｕｆｅｎｇ２ꎬＺＨＥＮＧＷｅｉ２∗ꎬＱＩＮＳｈｕｉｊｉｅ１∗
(１.ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ㊀ａ.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｃｓꎻｂ.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＯｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄ
ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｕｉｚｈｏｕꎬＧｕｉｙａｎｇ５５００２５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＯｐｔｉｃｓ
ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｉｎｇꎬＳｈｅｎｚｈｅｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＡｄｖａｎｃｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ
ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｈｅｎｚｈｅｎ５１８０５５ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｗｅｐｒｏｐｏｓｅａｎｏｆｆ￣ａｘｉｓｐａｒａｂｏｌｉｃｍｉｒｒｏｒ(ＯＡＰＭ)ａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｗｈｉｃｈｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｉｍａｇｅｑｕａｌ￣
ｉｔｙｉｎｔｈｅｍａｒｇｉｎａｌａｒｅａｏｆｔｗｏ￣ｐｈｏｔｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ.ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｄｏｕｂｌｅｌｅｎｓｅｓａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍꎬｔｈｅＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆａｐａｉｒｏｆｐａｒａｂｏｌｉｃｍｉｒｒｏｒｓꎬａｎｄａｇａｌｖｏｓｃａｎｎｅｒｉｓｌｏｃａｔｅｄａｔｏｎｅｏｆｔｈｅｆｏｃｉ
ｏｆｔｈｅｐａｒａｂｏｌｉｃｍｉｒｒｏｒ.ＢｏｔｈｔｈｅｓｉｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｃａｎｓｉｇ￣
ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｔｈｅａｓｔｉｇｍａｔｉｓｍꎬｔｈｅｆｉｅｌｄｃｕｒｖａｔｕｒｅａｎｄｔｈｅｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｏｎｔｈｅｅｄｇｅｏｆｆｉｅｌｄｏｆｖｉｅｗ.Ｆｕｒｔｈｅｒ￣ｍｏｒｅꎬａｄｏｐｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｐｏｓｅｄａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍꎬｗｅｂｕｉｌｄａｔｗｏ￣ｐｈｏｔｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐ
ｅｗｉｔｈａｆｉｅｌｄｏｆｖｉｅｗｏｆ２.４ｍｍˑ２.４ｍｍａｎｄａｌａｔｅｒａｌｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ１μｍ.Ｕｓｉｎｇｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍꎬｔｈｅｎｅｕｒｏｎａｘｏｎｓｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅｂｒａｉｎｓｌｉｃｅｃａｎｂｅｃｌｅａｒｌｙｒｅ￣ｓｏｌｖｅｄ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｏｆｆ￣ａｘｉｓｐａｒａｂｏｌｉｃｍｉｒｒｏｒꎻｔｗｏ￣ｐｈｏｔｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙꎻａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｒｅｌａｙꎻａｂｅｒｒａｔｉｏｎꎻｌａｒｇｅｆｉｅｌｄ￣ｏｆ￣ｖｉｅｗ
第２９卷第３期２０２０年６月
激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报
ＡＣＴＡ㊀ＬＡＳＥＲ㊀ＢＩＯＬＯＧＹ㊀ＳＩＮＩＣＡ
Ｖｏｌ.２９Ｎｏ.３Ｊｕｎ.２０２０
收稿日期:２０２０￣０３￣０３ꎻ修回日期:２０２０￣０４￣０７ꎮ
基金项目：国家自然科学基金仪器项目(８１９２７８０３)ꎻ国家自然科学基金优秀青年科学基金项目(８２８２２０２３)ꎻ深圳市
基础研究学科布局项目(ＪＣＹＪ２０１７０８１８１６４３４３３０４)ꎮ
作者简介：姚靖ꎬ硕士研究生ꎮ
∗通讯作者：秦水介ꎬ教授ꎬ主要从事微型电子机械系统和激光技术方面的研究ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈｕｉｊｉｅ＿ｑｉｎ＠ｓｉｎａ.ｃｏｍꎻ
郑炜ꎬ研究员ꎬ主要从事生物医学光子学㊁荧光多参量显微成像技术及应用㊁非线性光学显微技术及应
用等方面的研究ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈｅｎｇｗｅｉ＠ｓｉａｔ.ａｃ.ｃｎꎮ
㊀㊀双光子显微镜(ｔｗｏ￣ｐｈｏｔｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙꎬＴＰＭ)具备快速㊁高分辨和三维成像能力ꎬ被广泛地应用于生物医学[１]㊁材料科学[２]和电子科学[３]等研究领域ꎮ随着脑科学研究的逐渐升温ꎬ双光子显微技术得到了进一步的发展ꎮ包括组织光透明[４]㊁自适应光学[５]等技术的开发使得ＴＰＭ在小鼠脑内的纵向成像深度得到了很大的提高ꎬ但横向视场却主要限制在０.５ｍｍˑ０.５ｍｍ左右ꎬ这种成像视场的局限使得ＴＰＭ难以开展多脑区的神经活动成像研究ꎮ所以ꎬ如何实现大视场高分辨ＴＰＭ成像已经成为了目前光学显微成像领域的研究热点之一[６￣９]ꎮ
扫描系统设计对于实现大视场高分辨的双光子成像起着至关重要的作用ꎮ检流计振镜可以灵活地控制扫描角ꎬ从而调节激光扫描区域的大小ꎬ这种特性使得它被广泛地应用于ＴＰＭ的二维扫描系统中ꎮ最
早使用于ＴＰＭ的二维扫描系统是由Ｘ方向和Ｙ方向的两片检流计振镜紧挨着构成的ꎬ中间没有中继光学系统[１０ꎬ１１]ꎮ这种设计比较简洁ꎬ便于安装调试ꎬ但是该方法无法使两片振镜同时共轭到物镜后背孔径处ꎬ所以不可避免地会使部分激光能量在扫描过程中损失掉ꎮ并且ꎬ由于受第一片扫描镜的扫描角度的限制ꎬ第二片扫描镜需要增大面积ꎬ从而限制了它的扫描速度[１２]ꎮ在两片检流计振镜中间加入提供中继作用的透镜系统能有效地解决上述问题ꎬ并且已经成为常见的ＴＰＭ扫描系统之一[１３￣１６]ꎮ但是ꎬ要满足ＴＰＭ大视场的成像需求ꎬ该扫描系统存在一系列技术难点ꎬ包括:１)现有的商业透镜由于孔径和焦距的限制ꎬ在大角度扫描的情况下ꎬ扫描光束很难全部通过共焦透镜中继ꎻ２)即使光束全部通过共焦透镜中继ꎬ但是随着扫描角度的增大ꎬ透镜共焦扫描中继会产生较大的像差[９ꎬ１７]ꎬ对系统的成像质量造成严重的影响ꎬ包括成像面的扫描光强沿视场径向方向衰减ꎬ成像面不平整等ꎻ３)由于ＴＰＭ需要飞秒激光作为光源ꎬ其一般为宽光谱系统ꎮ针对宽光谱ꎬ透镜系统引入的差会造成飞秒脉冲展宽ꎬ使得双光子激发荧光信号急剧减弱[１８]ꎮ目前ꎬ高端商业ＴＰＭ会使用专门设计和加工的透镜中继系统ꎬ这能极大地改善以上问题ꎬ但是ꎬ其设计难度和加工成本较高ꎬ不适合于探索性为主的实验室研究需求ꎮ如何在维持成像质量不变的前提下提升扫描范围同时控制硬件成本仍是当前ＴＰＭ扫描系统开发待解决的重点问题ꎮ
相对于透镜中继系统而言ꎬ反射镜中继系统具有天生的无差优势ꎮ美国Ａｍｏｓ等[１９]在９０年代初就提出了利用共焦球面反射镜作为中继系统ꎬ并
且申请了专利ꎮ该系统利用一对球面反射镜共焦放
置来实现扫描中继ꎬ它很好地解决了中继系统的
差问题ꎬ目前已经被广泛地应用于需要更宽光谱的
共聚焦显微系统中ꎮ早期的双光子显微镜也有用该
系统作为中继的ꎬ但是由于仅使用一对球面反射镜ꎬ
无法有效地补偿像差ꎬ限制了双光子成像视场ꎬ一般
视场仅为０.５ｍｍˑ０.５ｍｍ左右[１８ꎬ２０]ꎮＳｈａｒａｆｕｔｄｉ￣ｎｏｖａ等[２０ꎬ２１]的研究指出ꎬ相对于共焦球面反射镜系统ꎬ离轴抛物镜共焦系统能提供更好的扫描线性度
和扫描光斑质量ꎬ预测该系统可以实现更高成像质
量的共聚焦或双光子成像ꎮ然而ꎬ该研究仍缺乏离
轴抛物镜共焦系统像差ꎬ如球差(ｓｐｈｅｒｉｃａｌａｂｅｒｒａ￣ｔｉｏｎ)㊁扫描过程中边缘视场的像散(ａｓｔｉｇｍａｔｉｓｍ)㊁场曲(ｆｉｅｌｄｃｕｒｖａｔｕｒｅ)和畸变(ｄｉｓｔｏｒｔｉ
ｏｎ)等的量化分析ꎮ至今为止ꎬ也没有相关研究将离轴抛物镜共焦系统与大视场双光子成像技术结合ꎬ来实现高成像质量的视场直径大于３ｍｍ的双光子成像ꎮ
在本文中ꎬ我们首先借助ＺＥＭＡＸ光学设计软件(Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ ２０２０ＺＥＭＡＸＬＬＣ.Ａｌｌｒｉｇｈｔｓｒｅｓｅｒｖｅｄ)进行仿真测试ꎬ在大扫描角度时ꎬ对离轴抛物镜(ｏｆｆ￣ａｘｉｓｐａｒａｂｏｌｉｃｍｉｒｒｏｒꎬＯＡＰＭ)共焦扫描中继系统与传统的双胶合透镜(ｄｏｕｂｌｅｔｌｅｎｓꎬＤＢ)式共焦扫描中继系统光学性能的优劣进行理论分析对比ꎮ包括系统调制传递函数(ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｔｒａｎｓｆｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎꎬＭＴＦ)分析ꎬ系统场曲㊁像散与畸变分析ꎬ系统球差分析以及物镜聚焦后光斑点列图与圈入能量的分析ꎮ其次ꎬ搭建了实际的光学系统ꎬ并测量比较了传统的ＤＢ与ＯＡＰＭ共焦扫描中继系统像面的聚焦光斑ꎮ最后ꎬ将ＯＡＰＭ扫描共焦中继加入到自主搭建的双光子显微成像系统中ꎬ实现了２.４ｍｍˑ２.４ｍｍ(视场直径３.４ｍｍ)的大视场小像差的成像ꎬ横向分辨率为１μｍꎬ纵向分辨率为１１μｍꎮ利用此显微镜ꎬ我们在２.４ｍｍˑ２.４ｍｍ的大视场下能够清晰地分辨小鼠大脑切片中微米量级的神经轴突结构ꎮ仿真结果和试验结果均表明ꎬＯＡＰＭ中继系统能有效地解决大视场扫描过程中由扫描系统引起的线性误差和视场边缘像差问题ꎮ值得一提的是ꎬ本文所涉及的所有光学部件都是现成商业光学元件ꎬ无需定制ꎬ能极大地缩减双光子系统开发的时间和经济成本ꎮ采用本文提出的离轴抛物镜共焦扫描系统能为扫描显微镜技术研发提供较大便利ꎮ
８１２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第２９卷
１㊀材料与方法敌对势力
基于ＯＡＰＭ的共焦扫描中继系统ＺＥＭＡＸ模拟光路图如图１ａ所示ꎮ入射光经Ｘ振镜(位于ＯＡＰＭ￣
１的焦点处)反射后ꎬ通过一对离轴抛物镜(ＭＰＤ２２９￣Ｍ０１ꎬ焦距ｆ＝５０.８ｍｍꎬ孔径Φ＝５０.８ｍｍꎬＴｈｏｒｌａｂｓꎬＺＥＭＡＸ参数见表１)构成的中继系统ꎬ共轭到Ｙ振镜(位于ＯＡＰＭ￣２的焦点处)ꎬ再由一个Ｆ￣ｔｈｅｔａ矫正扫描透镜(ＬＳＭ５４￣８５０ꎬ焦距ｆ＝５４ｍｍꎬＴｈｏｒｌａｂｓ)聚焦ꎮ使用多重态的方形反射镜(Ｘ方向倾斜机械角为:
０ʎꎬ１ʎꎬ ꎬ６ʎ)来模拟检流计振镜扫描过程ꎬ并进行ＭＴＦ分析ꎮ使用视场角(Ｙ方向视场角参数为:０ʎꎬ
２ʎꎬ ꎬ１２ʎ)来模拟振镜扫描角ꎬ并进行像差与光斑属性分析ꎮ入瞳位置放置于Ｘ￣扫描振镜面ꎬ入瞳直径设置为５ｍｍꎬ波长为７６０ｎｍꎮ作为对照ꎬ传统的ＤＢ共焦中继系统ＺＥＭＡＸ模拟光路如图１ｂ所示ꎬ将ＯＡＰＭ共焦扫描中继系统的ＯＡＰＭ组更换为双胶合透镜组(８９６８３ꎬ焦距ｆ＝５０ｍｍꎬ孔径Φ＝４０ｍｍꎬＥｄ￣
ｍｕｎｄꎬＺＥＭＡＸ参数见表２)ꎬ其余组件保持不变
ꎮ
图１㊀ＤＢ和ＯＡＰＭ扫描中继系统结构示意图Ｆｉｇ.１㊀ＤＢａｎｄＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓｅｔｕｐ
(ａ)ＺＥＭＡＸ模拟ＯＡＰＭ共焦扫描中继系统图ꎻ(ｂ)ＺＥＭＡＸ模拟ＤＢ共焦扫描中继系统图ꎻ(ｃ)ＯＡＰＭ共焦扫描中继像面光斑测量光路图ꎻ(ｄ)ＤＢ共焦扫描中继像面光斑测量光路图
(ａ)ＯｐｔｉｃａｌｌａｙｏｕｔｏｆｔｈｅＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｉｎＺＥＭＡＸꎻ(ｂ)ＯｐｔｉｃａｌｌａｙｏｕｔｏｆｔｈｅＤＢａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｉｎＺＥＭＡＸꎻ(ｃ)ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｅｔｕｐｏｆＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍꎻ(ｄ)ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｅｔｕｐｏｆＤＢａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ
㊀㊀图１ｃ和１ｄ是实际搭建的光学系统示意图ꎮ图中激光(ＣｈａｍｅｌｅｏｎＵｌｔｒａＩＩꎬ７００~１０００ｎｍｔｕｎａｂｌｅꎬＣｏｈｅｒ￣
ｅｎｔ)出射后ꎬ通过４倍扩束系统(焦距ｆ１＝５０ｍｍꎬｆ２＝２００ｍｍ)进行扩束ꎬ其后放置一个直径５ｍｍ光阑ꎬ之后分别通过ＯＡＰＭ共焦扫描中继系统和传统ＤＢ共焦扫描中继系统ꎬ再由Ｆ￣ｔｈｅｔａ矫正扫描透镜进行聚焦ꎬ在扫描透镜焦点处使用ＣＣＤ(Ｅ３ＣＭＯＳꎬ３０７２ｐｉｘｅｌｓˑ２０４８ｐｉｘｅｌｓꎬＴｏｕｐＴｅｋ)进行光斑测量分析ꎮ
表１㊀ＺＥＭＡＸ模拟ＯＡＰＭ参数(ｍｍ)
Ｔａｂ.１㊀ＴｈｅｐａｒａｍｅｔｅｒｏｆＯＡＰＭｉｎＺＥＭＡＸｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ(ｍｍ)
ＣｏｎｉｃＧｌａｓｓ
Ａｐｅｒｔｕｒｅ
无水乙腈ｔｙｐｅＭｉｎｉｍｕｍ
ｒａｄｉｕｓＭａｘｉｍｕｍ
ｒａｄｉｕｓＡｐｅｒｔｕｒｅ
Ｘ￣ｄｅｃｅｎｔｅｒＡｐｅｒｔｕｒｅ
Ｙ￣ｄｅｃｅｎｔｅｒ￣１
Ｍｉｒｒｏｒ
Ｃｉｒｃｕｌａｒａｐｅｒｔｕｒｅ０
２５.４
５０.８
０
９
１２第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀姚㊀靖等：离轴抛物镜扫描中继系统提升双光子显微成像视场㊀㊀㊀
表２㊀ＺＥＭＡＸ模拟双胶合透镜参数(ｍｍ)
Ｔａｂ.２㊀ＴｈｅｐａｒａｍｅｔｅｒｏｆｄｏｕｂｌｅｔｌｅｎｓｉｎＺＥＭＡＸｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ(ｍｍ)
Ｓｕｒｆａｃｅ:ｔｙｐｅＲａｄｉｕｓ
ＴｈｉｃｋｎｅｓｓＧｌａｓｓＳｅｍｉ￣ｄｉａｍｅｔｅｒ
１:Ｓｔａｎｄａｒｄ－１５３.６６６－７.０００Ｎ－ＳＦ５
渔港之夜
１９.５００２:Ｓｔａｎｄａｒｄ－２９.９６５
－１９.０００Ｎ－ＳＫ１１
１９.５００３:Ｓｔａｎｄａｒｄ
２８.５５８
－４８.２９０
－
１９.５００
２㊀结果与分析
东方城市花园会所２.１㊀仿真结果与分析
２.１.１㊀场曲㊁像散和畸变分析
场曲㊁像散和畸变是系统像差的重要组成部分ꎮ
场曲表示为子午(ｔａｎｇｅｎｔｉａｌꎬＴ)或弧矢(ｓａｇｉｔｔａｌꎬＳ)光束的交点沿光轴方向到高斯像面的距离ꎮ像散则描述子午像点和弧矢像点在光轴上分开的距离ꎮ对于传统的ＤＢ共焦扫描中继系统ꎬ如图２ａ所示ꎬ在像面ꎬ随着扫描角度的增加ꎬ即沿＋Ｙ方向ꎬ场曲和像散逐渐增大ꎬ对比扫描角
生物学教学度为１２ʎ与０ʎ(不扫描)时的情况ꎬ场曲造成的子午方向(Ｔ)轴向移动为－２３.１３ｍｍꎬ弧矢方向(Ｓ)为－７.８２ｍｍꎬ子午(Ｔ)
和弧矢(Ｓ)像点不重合造成的像散(子午场曲与弧矢场曲之差)为－１５.３１ｍｍꎮ这表明了ＤＢ共焦扫描中继系统在进行大扫描角度成像时会有极为严重的场曲和像散ꎮ该场曲会导致样品面扫描场为大曲率的曲面ꎬ将严重影响成像质量ꎮ而子午像点和弧矢像点的不重合导致的像散ꎬ则导致样品面焦点在某一方向拉长ꎬ在成像过程中造成Ｘ方向和Ｙ方向的分辨率不等ꎮ
对于本文提出的ＯＡＰＭ扫描中继系统中的场曲和像散ꎬ如图２ｂ所示ꎬ对比扫描角度为１２ʎ与０ʎ(不扫描)时的情况ꎬ场曲造成的子午方向(Ｔ)轴向移动为＋０.０７ｍｍꎬ弧矢方向(Ｓ)大致为－０.１０ｍｍꎮ子午(Ｔ)和弧矢(Ｓ)方向像点不重合造成的像散也仅为＋０.１７ｍｍ左右ꎮ这证明了相比于传统的ＤＢ系统ꎬＯＡＰＭ共焦扫描中继系统在场曲与像散方面有了明显的优化
ꎮ
图２㊀ＤＢ和ＯＡＰＭ扫描中继系统的场曲和畸变曲线对比
Ｆｉｇ.２㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｆｉｅｌｄｃｕｒｖａｔｕｒｅａｎｄｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｂｅｔｗｅｅｎＤＢａｎｄＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ
(ａ)ＤＢ共焦扫描中继像面的场曲曲线ꎻ(ｂ)ＯＡＰＭ共焦扫描中继像面的场曲曲线ꎻ(ｃ)ＤＢ共焦扫描中继像面的畸变曲线ꎻ(ｄ)ＯＡＰＭ共焦扫描中继像面的畸变曲线
(ａ)ＴｈｅｆｉｅｌｄｃｕｒｖａｔｕｒｅｐｒｏｆｉｌｅｉｎｔｈｅｉｍａｇｅｐｌａｎｅｏｆＤＢａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍꎻ(ｂ)Ｔｈｅｆｉｅｌｄｃｕｒｖａｔｕｒｅｐｒｏｆｉｌｅｉｎｔｈｅｉｍａｇｅ
ｐｌａｎｅｏｆＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍꎻ(ｃ)ＴｈｅｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｉｎｔｈｅｉｍａｇｅｐｌａｎｅｏｆＤＢａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍꎻ
(ｄ)ＴｈｅｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｉｎｔｈｅｉｍａｇｅｐｌａｎｅｏｆＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ
㊀㊀畸变是垂轴像差ꎬ不会影响像的清晰程度ꎬ只会改变轴外物点在像面的成像位置ꎮ在ＴＰＭ中ꎬ系统的畸变会对扫描过程的线性造成影响ꎬ畸变越小ꎬ则扫描过程越趋于线性ꎮ从图２ｃ和２ｄ中ꎬ可以看到两系统的畸变对比ꎬＯＡＰＭ共焦扫描中继系统的畸变
(－１.５７％)相比于传统的ＤＢ共焦扫描中继系统(－２.７５％)也减小了将近１倍ꎮ所以ꎬ使用ＯＡＰＭ
共焦扫描中继作为双光子显微成像系统的扫描中继系统ꎬ在扫描线性度方面能得到明显的提升ꎮ
０２２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀激㊀光㊀生㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀
第２９卷
２.１.２㊀球差分析
球差是轴上点像差ꎬ即轴上点发出的同心光束
经光学系统后ꎬ不再是同心光束ꎬ不同入射高度的光线经过光学系统后交光轴于不同位置ꎬ相对于近轴像点有不同程度的偏离ꎬ导致在高斯像面的像点不是一个点ꎬ而是一个圆形的弥散斑ꎮ球差会使本应该集中在中心位置处的能量弥散ꎮ在ＴＰＭ中能量的弥散会造成分辨率下降以及信噪比降低ꎮ传统的ＤＢ
共焦扫描中继和ＯＡＰＭ共焦扫描中继的轴向球差曲线如图３ａ和３ｂ所示ꎬＯＡＰＭ共焦扫描中继系统的球差仅是ＤＢ中继系统的１/４左右
ꎮ
图３㊀ＤＢ和ＯＡＰＭ扫描中继系统的轴向球差对比Ｆｉｇ.３㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｐｈｅｒｉｃａｌａｂｅｒｒａｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｂｅｔｗｅｅｎＤＢａｎｄＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ(ａ)ＤＢ共焦扫描中继像面的轴向球差曲线ꎻ(ｂ)ＯＡＰＭ共焦扫描中继像面的轴向球差曲线
(ａ)ＴｈｅｌｏｎｇｉｔｕｄｅｓｐｈｅｒｉｃａｌａｂｅｒｒａｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｉｎｔｈｅｉｍａｇｅｐｌａｎｅｏｆＤＢａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍꎻ(ｂ)ＴｈｅｌｏｎｇｉｔｕｄｅｓｐｈｅｒｉｃａｌａｂｅｒｒａｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｉｎｔｈｅｉｍａｇｅｐｌａｎｅｏｆＯＡＰＭａｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ
２.１.３㊀调制传递函数ＭＴＦ对比分析
调制传递函数ＭＴＦ是成像光学系统像质评价的
另一个重要指标ꎮ图４为不同扫描角下的ＭＴＦ曲线ꎬ其横坐标表示空间频率ꎬ单位为每毫米可分辨的线数ꎮＭＴＦ值降为０时的空间频率ꎬ称为截止频率ꎬ即系统分辨细节的能力ꎮ截止频率越大ꎬＭＴＦ曲线变化越平稳ꎬ空间频率和ＭＴＦ值围成的面积越大ꎬ则系统的成像质量越好ꎮ
在传统的ＤＢ共焦扫描中继系统(图４ａ)中ꎬ随着振镜扫描角的增大ꎬ系统能通过的截止频率出现严重地下降ꎮ当扫描角增大到６ʎ往上时ꎬ系统所能通过的空间频率成分不足衍射极限的１/１２ꎬ这时系统的成像性能已无法满足成像的需求ꎮ这种情况在
实际的扫描系统中会严重地影响到物镜下聚焦光斑的形状ꎬ导致这种情况的主要因素是当扫描角增大时ꎬ场曲增加ꎬ光束不能有效地聚焦在像面上ꎬ另外ꎬ由于子午弧矢方向焦点位置不同ꎬ像散增加ꎬ最终影响边缘视场的荧光信号强度和成像分辨率ꎮ
然而ꎬ在本文提出的ＯＡＰＭ扫描中继系统(图４ｂ)中ꎬ随着振镜扫描角度的增加ꎬ由于其对各类像差的优化ꎬ在各个扫描角的ＭＴＦ曲线中ꎬ截止频率和衍射极限曲线相同ꎬ各频率成分的ＭＴＦ透过率同衍射极限ＭＴＦ相比只有极小的衰减ꎮ这说明在进行大视场扫描时ꎬＯＡＰＭ共焦扫描中继系统的成像性能和不扫描时(０ʎ)的基本相同ꎬ在ＴＰＭ中使用ＯＡＰＭ共焦扫描中继能显著地提高成像质量ꎮ
２.１.４㊀中继系统像面光斑分析
点列图分析是另一种较为直观的像质整体分析
方式ꎬ主要通过像面聚焦光斑的形状比较来观察整个成像系统的优劣ꎮ通过ＤＢ共焦扫描中继系统和ＯＡＰＭ共焦扫描中继系统之后在像面的点列图分别为图５ａ和５ｂ所示ꎮ对于传统的ＤＢ共焦扫描中
继系统(图５ａ)ꎬ随着扫描角的增大ꎬ由于严重的场曲㊁像散以及球差等的影响ꎬ像面光斑的均方根(ｒｏｏｔ￣ｍｅａｎ￣ｓｑｕａｒｅꎬＲＭＳ)半径从０ʎ视场角(衍射极限艾里
光斑半径为９.９０μｍ)的７μｍ弥散至１２ʎ视场角时的５８８μｍꎮ对于本文提出的ＯＡＰＭ共焦扫描中继系统在像面的点列图ꎬ即使在大扫描角度１２ʎ的时候ꎬ光斑的ＲＭＳ半径为７.０９μｍꎬ同衍射极限９.９０μｍ相近ꎮ与像面的光斑点列图相对应ꎬ图５ｃ和５ｄ分别为传统的ＤＢ共焦扫描中继系统和ＯＡＰＭ共焦扫描中继系统的像面圈入能量图ꎮ对于ＤＢ共焦扫描中继系统ꎬ随着扫描角的增大ꎬ聚焦光斑逐渐弥散ꎻ而对于ＯＡＰＭ共焦扫描中继系统ꎬ即使大角度扫描时ꎬ聚焦光斑也基本上集中于艾里光斑内ꎮ
２.２㊀试验结果与分析
２.２.１㊀中继系统像面光斑形状测量
实际系统很难精确测得各类像差的具体分量ꎬ
考虑到我们设计中继系统的最终目的是为了实现高分辨大视场成像ꎬ具体体现在双光子成像系统上就是要求在样品面上有较好的光学聚焦光斑ꎬ所以在实际试验验证系统中ꎬ我们通过测量不同扫描角的光斑形状来对比模拟分析结果ꎮ我们搭建了如图１ｃ和１ｄ所示的光斑测量系统ꎬ由测量系统得到不同扫描角下两个中继系统的光斑分布情况ꎬ如图６所示ꎮ
１
２２第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀姚㊀靖等：离轴抛物镜扫描中继系统提升双光子显微成像视场㊀㊀㊀
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