DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.003·
文海若，任璐，罗飞亚，汪祺
【摘要】
目的比较细胞松弛素A（Cyto A）及细胞松弛素 B （Cyto B）对微核试验常用细胞系——中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）毒性及对体外微核试验结果的影响。
方法在荧光显微镜下观察由微丝组成的应力纤维结构，并使用CHL 开展胞质分裂阻断法微核试验，比较两者对多核细胞率及含微核双核细胞率的影响。
结果不同浓度的Cyto A 和Cyto B 与细胞作用24 h 后，与对照组（26% ± 7%）比较均可诱导多核细胞形成率的显著升高（Cyto A 及Cyto B 3.0 μg/ml 浓度组分别为58% ± 12% 和72% ± 9%，P < 0.001），且Cyto A 在3.0 μg/ml 浓度条件下诱导的平均多核细胞率与 1.5 μg/ml 浓度组比较有所降低。Cyto A 处理组在MMC 浓度分别为0、0.1 和0.3 μg/ml 时的微核率分别为0.25% ± 0.16%、1.98% ± 0.59% 和3.80% ± 0.90%；而Cyto B 处理组在相同MMC 浓度时的微核率分别为0.32% ± 0.16%、2.50% ± 0.61% 和5.05% ± 1.09%。
结论虽然Cyto B 的多核细胞造模效果略优于Cyto A，两者均可有效用于胞质分裂阻断法微核研究。研究结果将为相关领域研究者提供可借鉴的实际经验。
【关键词】细胞松弛素类；微核试验；肌动蛋白类；胞质分裂阻断法
体外哺乳动物细胞微核试验以细胞过程中形成的独立于主核的染单体或染体断片为生物标志物，来评估受试物的潜在致染体损伤能力。染体损伤是肿瘤形成的分子基础之一，微核形成率可用于对受试物的潜在致癌风险预测。因其试验方法较为简便，体外微核试验已广泛应用于环境诱变剂、保健食品、化妆品、医疗器械和药物的安全性评价[1-3]。使用体外培养细胞开展常规微核法（conventional micronucleus methods）时对给药后所有细胞的微核率进行分析，不对细胞核分裂次数进行区分。该方法无法排除细胞自发微核背景值，且微核率可随细胞分裂次数而升高，故往往结果有所偏差。Fenech 等[4]于1985 年在微核试验的受试物与细胞处理时加入了抑制细胞质分裂的细胞松弛素，可通过计数细胞核数量对受试物细胞增殖的影响以及计数细胞的分裂次数进行限定。该方法即胞质分裂阻断法微核试验（cytokinesis-block micronuceus cytome assay），仅分析完成一次分裂的
双核细胞的微核率，从而提高结果的准确性。可见细胞松弛素的应用在上述试验体系中有重要作用。
细胞松弛素原本是一组真菌代谢产物，包括细胞松弛素A、B、C、D、E、F、H 和J[5]。它可与细胞的微丝结合并切断微丝，从而抑制微丝与肌动蛋白的结合。而肌动蛋白可与细胞核的定位、定向移动和胞质分裂时染体结构的维持有关[6]。当肌动蛋白功能受到干扰时，染体的集缩与基因转录可受到影响[7]。此外，有研究显示Cyto B 可诱发细胞脱核，并可用于制备大量无核细胞质体和无胞质的核质体用于细胞融合、细胞核、细胞质成分分析及染质基因转移技术等多种研究[8]。
微核试验中常用的造模试剂细胞松弛素为Cyto B 和Cyto A（结构见图1），Cyto B 是体外微核试验指导原则规定使用的试剂[9]，而获得困难时，有时也在微核试验中使用具有相似功能的Cyto A。初次试验者在购买试剂时容易将两者混淆。本研究比较了两者对微核试验常用细胞系中国仓鼠肺成纤维细胞（Chinese hamster lung fibroblast，CHL）的细胞毒性及对体外微核试验结果的影响。
基金项目：国家自然科学基金（81503347）；国家十三五“重大新药创制”专项课题（2018ZX09201017）
赖特作者单位：100176 北京，中国食品药品检定研究院安全评价研究所（文海若、任璐），化妆品检定所（罗飞亚），中药民族药检定所（汪祺）；510006 广州，中山大学药学院（任璐）
通信作者：汪祺，Email：sansan8251@sina；罗飞亚，Email：feiya.
收稿日期：2019-01-16
细胞松弛素A 细胞松弛素B
Cytochalasin A Cytochalasin B
图 1细胞松弛素 A 与细胞松弛素 B 的化学结构
Figure 1Chemical structures of cytochalasin A and
cytochalasin B
1 仪器与材料
1.1 材料
1.1.1实验仪器BX40 型正置光学显微镜购自
日本Olympus 公司；5810R 型离心机购自美国
Eppendorf 公司；NTS-1300 恒温振荡水槽购自东
京理化器械株式会社；荧光酶标仪购自美国伯腾公
司；Operetta 高内涵成像系统购自英国珀金埃尔默
公司。
1.1.2材料与试剂ddH2O 使用本中心
MilliQ-A10 超纯水机生产的超纯水，121 ℃、15 min
高压灭菌，4 ℃冰箱保存；RPMI 1640 培养基、
1% 青链霉素混合液、0.25% 胰蛋白酶-EDTA、胎
牛血清均购自美国Gibco 公司；DMSO 购自美国
Sigma 公司；PBS 购自美国Hyclone 公司；Cyto A
与Cyto B购自北京索莱宝科技有限公司，用
DMSO 配成 5 mg/ml 溶液，–20 ℃保存；
Perm/Wash buffer（554723）购自美国BD 公司；
Alexa Fluor TM488 鬼笔环肽（A12379）购自美国
ThermoFisher 公司；Hoechst 33342 购自美国
Invitrogen 公司。细胞为中国仓鼠肺细胞（Chinese
hamster lung cell，CHL）第4 ~ 6 代，来自中国科
学院上海生命科学研究院细胞资源中心，液氮
保存。
1.2 方法
1.2.1细胞松弛素对微丝的影响
大卫克劳斯1.2.1.1细胞培养及处理无菌条件下，CHL 细
胞使用含10% 小牛血清及1% 青链霉素的
RPMI 1640 在37 ℃，CO2体积分数为5% 的恒
温培养箱中培养。细胞达到对数生长期后，以1 ×
105个/孔接种于6 孔细胞培养板，继续培养18 ~
24 h。
1.2.1.2染与固定观察细胞培养情况，移除
含Cyto A 或Cyto B 的培养基，使用0.1 ml PBS
冲洗细胞 2 次，移除液体。每孔加入0.1 ml 含
3.7% 甲醇的PBS 溶液固定，室温孵育20 min 后
移除液体。每孔加入0.1 ml PBS 清洗细胞 3 次，
每次10 min，清洗后移除液体。每孔加入0.1 ml 鬼
笔环肽的 1 × 工作液染，室温孵育60 min 后移
除液体。每孔加入0.1 ml PBS 清洗细胞 3 次，每
次 5 min，清洗后移除液体。每孔加入100 μl 含
Hoechst 33342（终浓度5 μg/ml 或16.23 μmol/L）
的PBS（含1% 胎牛血清）混合液，37 ℃、5% CO2
条件下避光染10 min。移除含染料的培养基，使
用PBS 100 μl 清洗2 次，每次 5 min，最后一次
洗后剩余液体不移除。
1.2.1.3镜下观察使用Operetta CLS 高内涵
分析系统在400 × 倍荧光显微镜下对微丝及细胞
核形态观察及拍照。
1.2.2体外胞质分裂阻断法微核试验
1.2.2.1给药处理胞质分裂阻断法微核试验简
述如下[10]。细胞培养方法同 1.2.1.1。在无代谢活化
条件下，细胞分别给予0.1 和0.3 μg/ml 的丝裂霉
素C（MMC）与细胞共同作用 6 h 后，更换含浓
度为 1.0、1.5 和3.0 μg/ml 的Cyto A 和Cyto B
的培养液与细胞继续作用约24 h（1.5 个细胞倍增
周期）。同时设0.5% DMSO 为对照组。每个条件
3 个复孔。
1.2.2.2制片与染使用胰蛋白酶-EDTA 消化
细胞，并将细胞悬液于1000 r/min 离心 5 min 后
收获。细胞经不含钙、镁离子的杜氏磷酸缓冲液
（Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS）洗
涤 2 次后，加入预温的0.075 mol/L KCl 溶液于
37 ℃低渗处理不超过5 min。加入甲醇：冰醋酸
（3:1）对样本进行固定，并经1000 r/min 离心
5 min 后弃上清。重复固定2 次。滴片、待玻片干
燥后浸入5% 姬姆萨溶液，染约25 min。标本
染后使用自来水冲洗并在室温下自然干燥。
1.2.2.3 镜检指标显微镜下观察并计数：①每
个剂量组玻片标本中500 个细胞中多核细胞数，
并计算多核细胞百分率；②2000 个双核细胞中微
核数，并计算微核形成百分率。
1.3 统计及数据分析
赵茂辰
所有数据均以s
x 表示，采用GraphPad
Prism 5 软件，对3 组及以上数据采用单因素方差
分析，P < 0.05 为差异有统计学意义。
0.5% 二甲基亚砜 1.5 μg/ml 细胞松弛素 A 1.5 μg/ml 细胞松弛素 B 0.5% DMSO 1.5 μg/ml Cyto A
1.5 μg/ml Cyto B
图 2 细胞松弛素 A 与细胞松弛素 B 对微丝形态的影响
Figure 2 Effects of cytochalasin A and cytochalasin B to the morphology of actin filament
2 结果
2.1 比较细胞松弛素 A 与 B 对微丝的影响
使用荧光抗体标定微丝和细胞核后，在荧光显微镜下（400 ×）可见由微丝组成的应力纤维结构 （图 2）。细胞在贴壁条件下生长时，应力纤维与细胞长轴平行。Cyto A 及 Cyto B 作用后，应力纤维形成的网状结构有所破坏，细胞形态变得狭长，并可诱导双核细胞的形成。
2.2 比较细胞松弛素 A 与 B 对体外胞质分裂阻断法微核结果的影响
CHL 细胞的倍增周期约为 16 h ，不同浓度的 Cyto A 和 Cyto B 与细胞作用 24 h （约 1.5 个细胞倍增周期）后，每浓度组分别计数 500 个细胞中的单核与多核细胞数（图 3）。与对照组（26% ± 7%）
比较 Cyto A 及 Cyto B 均可诱导多核细胞（双核及以上）形成率显著升高（3.0 μg/ml 浓度组分别为 58% ± 12% 和 72% ± 9%，P < 0.001），且 Cyto A 在 3.0 μg/ml 浓度条件下诱导的平均多核细胞率与 1.5 μg/ml 浓度组比较略有降低。1.0 及 3.0 μg/ml Cyto A 与相同浓度 Cyto B 相比，所诱导的多核细胞形成率显著降低（P < 0.001），可能与 Cyto A 的胞质分裂阻断能力和细胞毒性有关。上述结果虽然试验选用浓度范围下 Cyto A 与 Cyto B 均可有效诱导大量多核细胞的形成，但 Cyto B 的多核细胞造模效果略优于 Cyto A 。
多核细胞率（%） M u l t i n u c l e a t e d c e l l r a t i o (%)
1009080706050403020100
1.0 1.5 3.0 1.0 1.5 3.0 0.5% 二甲基亚砜 细胞松弛素 A 细胞松弛素 B 0.5% DMSO Cyto A Cyto B 浓度（μg/ml ）
Concentrations (μg/ml)
图 3 细胞松弛素 A 与细胞松弛素 B 对多核细胞率的影
响（n = 500，*P < 0.001，与 0.5% DMSO 组比较；#
P < 0.001，与相同浓度 Cyto A 组比较）
Figure 3 Effects of cytochalasin A and cytochalasin B to the ratio of multinucleated cells (n = 500, *P < 0.001, comparing to 0.5% DMSO group; #P < 0.001, comparing to Cyto A group of the same concentration)
以 1.5 μg/ml 为 Cyto A 和 Cyto B 处理浓度，分别给予不同浓度的体外微核试验阳性剂 MMC 来评价 Cyto A 和 Cyto B 对微核形成率的影响。含微核的双核 CHL 细胞形态如图 4A 所示。Cyto A 处理组在 MMC 浓度分别为 0、0.1 和 0.3 μg/ml 时的微核率分别为 0.25% ± 0.16%、1.98% ± 0.59% 和 3.80% ± 0.90%；而 Cyto B 处理组在相同 MMC 浓度时的微核率分别为 0.32% ± 0.16%、2.50% ± 0.61% 和 5.05% ± 1.09%。阴性背
细胞松弛素A 细胞松弛素B Cyto A Cyto B
丝裂霉素C 0.1 μg/ml
MMC 0.1 μg/ml A 微
核
细
胞
发
生
率
（
%
）
M
i
c
r
o
n
u
c
l
e
a
t
e
d
c
e
l
l
r
a
t
i
o
测井(
%
)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0 0.1 0.3 0 0.1 0.3
细胞松弛素A 细胞松弛素B
Cyto A Cyto B
浓度（μg/ml）
Concentrations (μg/ml) B
图 4细胞松弛素 A 与细胞松弛素 B 对含微核双核细胞率的影响（n = 2000；A：含微核的双核细胞图例；B：含微核双核细胞发生率分析结果；**P < 0.01，与Cyto A-MMC 0 μg/ml 组比较；##P < 0.01，与Cyto B-MMC 0 μg/ml 组比较）Figure 4Effects of cytochalasin A and cytochalasin B to the ratio of micronucleated cells (n = 2000; A: Representative image of binucleated cells containing micronuclei;
B: Data analysis of the incidence on binucleated cells containing micronuclei; **P < 0.01, comparing to Cyto A-MMC 0 μg/ml group; ##P < 0.01, comparing to Cyto B-MMC 0 μg/ml group)
景值在文献报道范围之内[10-12]。无论经Cyto A 或Cyto B 处理，0.1 和0.3 μg/ml MMC 均可诱导CHL 细胞双核细胞微核率显著性升高，且存在剂量相关性（P < 0.01），但相同MMC 浓度条件下Cyto A 或Cyto B 处理组之间的微核率无显著性差异。提示Cyto A 和Cyto B 均可用于胞质分裂阻断法微核试验。
3 讨论
微丝为直径约7 nm 的肌动蛋白纤维，与微管和中间纤维共同构成细胞骨架，是决定细胞形状和维持细胞内部区域化的重要结构[13]。微丝在细胞运动、跨膜运输和细胞分裂、信号传导等过程中发挥决定性作用。在动物细胞的有丝分裂末期，在子代细胞之间形成由微丝构成的缢缩环，通过微丝束中肌动蛋白和肌球蛋白的收缩而隔断子代细胞的细胞质，形成两个独立的子代细胞[14]。细胞松弛素可抑制微丝的组装并破坏其三维网络[5]。因此，在细胞培养过程中添加细胞松弛素可形成核分离而细胞质不分离的多核细胞。
体外胞质分裂阻断法微核试验是常见的遗传毒性评价方法，在环境诱变剂、化妆品、保健食品及纳米材料毒理学评价及科研工作中得到广泛应用[15]。细胞松弛素的添加有助于对细胞分裂次数进行区分。
单核细胞中的微核提示与自身背景有关，与受试物作用无关；而微核率则随着细胞分裂次数增加而显著升高。因此通过限定计数双核细胞中的含微核细胞数，有助于排除非药物因素引起的微核率升高。而通过计数单核和多核细胞比例，也可对受试物细胞增殖的影响进行评价。此外，细胞松弛素的使用还可保留细胞分裂中期凋亡及坏死细胞形态，可对样本中凋亡及坏死细胞进行计数分析[16-17]。而双核细胞的形成，也使研究者可以对除微核外，另外一项生物标志物“核质桥”（nucleoplasmic bridges，NPB）进行观察。NPB 是双核细胞中位于两个主核之间连续的桥状核质，可提示DNA 错误修复或端粒末端融合效应。有研究提示NPB 对60Co γ 射线诱导的遗传物质损伤做出灵敏而可靠的判断[18]。OECD 指导原则推荐使用Cyto B 用于细胞造模，因Cyto A 具有相似阻断细胞质分离的效应，后者也可用于胞质分裂阻断法微核试验。本研究比较了两者对微核试验结果的影响，提示Cyto A 的细胞毒性略大于Cyto B，此外两者对双核细胞微核率的形成效应等同，使用Cyto A 对微核的形成无明显促进或抑制的作用，均可用于该研究。从作用机制角度分析，细胞松弛素对遗传物质无损伤作用，且对细胞分裂周期无明显影响。本研究中也未见Cyto A 及Cyto B 对微核率的形成存在显著性差异。
然而，细胞松弛素在微核试验中的应用也存在一定局限。因细胞松弛素对细胞骨架的形成有所干扰，可影响细胞对纳米材料等难溶受试物的内吞或摄取。故对于纳米材料，建议在给药后期再添加Cyto B（延迟的共同处理），或使用先给药再添加Cyto B（后处理）的方式，从而促进受试物与细胞培养系统在无Cyto B 的情况下充分暴露，提高其
与遗传物质的相互作用机会[19-20]。此外，细胞松弛素也可通过抑制细胞动力学干扰多倍体的形成，从而影响对潜在多倍体诱导剂毒性的判断[21]。
综上所述，使用细胞松弛素开展胞质分裂阻断法微核试验在生物监测和化合物毒性评价及研究中有一定用武之地。本研究比较了不同的细胞松弛素亚型，Cyto A 和Cyto B 对胞质分裂阻断法微核试验结果的影响。两者在体外微核试验中均可能涉及，但有关Cyto A 的文献报道寥寥，难以确定适宜的给药条件。本研究结果发现Cyto A 和Cyto B 均可有效用于胞质分裂阻断法微核研究，但后者的多核细胞造模效果略优于前者且细胞毒性较低。研究结果将为相关领域研究者的实际工作提供参考与借鉴。
志谢感谢珀金埃尔默公司（Perkin Elmer，北京）王瑜博士对荧光染及分析技术的支持。
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