西南国防医药2021年1月第31卷第1期•69 •淋巴细胞微核与染体畸变检验技术综述 刘冰，高志丹，陈晨，许杰，刘全斌，廖远祥，郝永建
[]淋巴细胞；微核；染体畸变；检验
R 817 A
文章编号 1004-0188(2021)01-0069-03 doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2021.01.021
随着经济社会的发展与科技进步，放射技术应用已覆
盖工业、医疗、交通、金融、体育、教育、科研等多个领域[1]。
放射线能够引起物质发生电离辐射，包括高速带电粒子琢
粒子、茁粒子、质子等以及X射线、酌射线等不带电粒子；
给人民生活带来便利的同时，也对接触人体健康造成了一
定程度的危害。
1淋巴细胞微核与染体畸变商场现代化
长期低剂量接触电离辐射，能够对人体机能造成诸多变化和损伤，其中的机体损伤标志物主要有外周血淋巴细胞其细胞核畸变产生的微核、染体畸变产生的染体断片、染体双着丝粒、环状染体等121。淋巴细胞微核是指受电离辐射影响后，分裂期淋巴细胞染体发生部分断裂，或是由于着丝粒丟失导致单独染体无法在分裂后期被纺锤丝牵引和游离于胞浆中，染体片段或单独染体自行螺旋成核状，呈现在淋巴细胞主核周围，大小一般不超过主核体积的1/3，一个或多个存在[3](如图1)；染体断片是指受长期低剂量电离辐射之后，分裂期淋巴细胞染体单条或双条脱氧核苷酸链发生断裂的现象，断裂染体可部分结合在整条染体之上，也可完全游离于细胞胞浆之中(图2)；染体双着丝粒是指淋巴细胞受长期低剂量电离辐射之后，染体的两臂于同一水平位置断裂，断片游离，而两臂的断端彼此愈合性结合，该染体着丝粒纵裂并在愈合点进行自身复制而成，或是双着丝粒染体由两组发生臂端断裂染体的四个断裂臂端，对位修复结合而成[51(图3)；环状染体是指淋巴细胞受长期低剂量电离辐射之后，染体臂多条完全断裂成为断片，断裂下来的两个断片彼此粘合成一个环状染体，而带着丝粒的染体部分可通过两断端的粘合而异常修复形成环状染体[6]。不管形成的原因如何，环状染体都被认为是淋巴细胞受电离辐射刺激后遗传性损害的较严重表现，多在各种肿瘤患者和血液病患者外周血淋巴细胞中呈阳性显现[7]。
2放射卫生法规介绍
放射线在工业上主要应用于电镀厚度测定、工业设备探伤、地下矿物勘测等领域，在医疗上主要应用于医用X 线、核医学、放射密封源等领域[8-9]。有报道指出，工业 放射线中危害性最大的是工业探伤所使用的X射线《。当
院军队“十三五”后勤器材科研项目（CEP18L010)
院100082北京，火箭军特医学中心
通信作者：郝永建，E-m ail:189****7491@189;liaoyjian@sina.
图1 ~3染体微核、断片、双着丝粒示意
相关工作人员接受大量射线照射时，机体会产生诸如头晕、恶心、呕吐等症状，严重时引起细胞遗传性病变损伤介人用射线是医疗放射线中危害性最强，其主要是在C T、超声、磁共振及数字减影血管造影机等影像设备的引导和视野下进行的微创手术，放射线种类复杂，辐射波叠加效应明显，且防护手段受手术操作规范限制，大多数相关遗传学危害人报道都针对长期从事一线手术室的医护工作人员[|丨1。
我国于上世纪末和本世纪初发布了多部关于放射接触人员接触放射剂量、放射人员健康防护、放射人员职业健康检查、放射事故应急等国家标准及试行方案。现阶段，相关部门对于放射工作人员受到长
期低剂量电离辐射后产生的细胞遗传学损伤防治法规，主要有2002年5月1日起实施的《中华人民共和国职业病防治法》以及随后出台的《国家职业卫生标准管理办法》《职业病危害项目申报管理办法》等多个卫生规章和规范性文件。职业卫生标准主要包括《工业企业设计卫生标准》和《工作场所有害因素职业接触限值》。随着细胞遗传学损伤新的研究进展不断深人，长期低剂量电离辐射损伤指标、参数有待在法规中更新。
真核细胞微核和畸变染体是由于细胞受到有害因子刺激作用后的一种遗传学表现，用以观察真核细胞中微核的形成及染体畸变，此类用来检测有害刺激因子的实验称为微核实验或染体畸变实验。微核实验和染体畸变实验通常是以动、植物真核细胞为材料，运用细胞生物学原理及相关方法检测染体畸变率(chromosomal aberration frequency,CA F)及微核率(mici'onucleusfi'equency, MF)，从而体现真核细胞受有害刺激因子的损伤程度。由于真核细胞分裂期远短于分裂间期，分裂期染体畸变显微镜检比分裂间期微核镜检要复杂得多，有人建议用微核实验代替染体畸变实验[12-13]。
真核细胞分裂阻滞微核分析法细胞分裂阻滞
微
•70 •西南国防医药2021年1月第31卷第1期核分析法(cytokinesisblockanalysis,CB)，即使用一定剂量的
细胞胞质分裂阻滞物在不干扰细胞核分裂的情况下，阻断
细胞质分裂，最终使得真核细胞有丝分裂呈现双核及双倍
数目染体状态，而未进人分裂期的真核细胞依然维持单
一细胞核的形态[9]。该方法可用于一定剂量致突变因素作
用后的双核细胞率及双核细胞微核率的检测，以获得该致
突变因素对细胞分裂周期的影响及遗传毒性损害的多种
信息[14]。在细胞分裂阻滞微核分析中，会检测出一定数目
的核质桥(nucleoplasm ic bridges,N PB)，即细胞质分裂阻滞
法制备出的桥状核质连接物，是端粒末端融合、D N A修复
错误或染体重排的生物学标志物。有文献表明，真核细胞中核质桥数量与电离辐射剂量成一定程度相关性，同时 在相同环境条件培养下，N P B数目与真核细胞中双着丝粒染体及环状着丝粒的数目呈正相关[15-16]。
微核自动化检测方法在20世纪70年代，流式细胞仪(Flow cytometry)微核检测方法逐步建立，用于定量测定细胞及亚细胞的成分。其优势在于其检测速度比人工快近100倍，还能减少人为主观干扰。新一代流式细胞仪增加了分选功能，对含有微核的真核细胞可做进一步分类收集，通过人工再次在显微镜下进行复检，保障了检测的特异度和灵敏度[17-18]。但流式细胞仪检测无法进行染体畸变的数据收集，且只针对于血液细胞成分，检测项目单一，不能满足各国国家标准规定的多个项目检测，检测成本较人工检测成本偏高。
3.3 计算机图像分析检测系统20世纪80年代中期，计算机图像分析检测系统(computer im age analysis system, CIAS)在德国出现(图4)。该系统是将高分辨率摄像机、显 微镜及自动运行设备与计算机系统结合，先由计算机将系统中摄像机采集到的图像分解，成为若干块，再将块的图像依据差转换为数字信号并进行储存，然后各规定模块启动定量参数的运算。其检测速度是人工速度的10 倍以上，且随着计算模块的不断强化，该系统已可同时检测各类真核细胞微核及染体畸变。图像自动分析检测具有较大的应用潜力，仪器价格能为普通实验室接受而有利于市场的推广，且能将畸变淋巴细胞涂片扫描为图像数据，便于长期储存、数据交流及回顾研究。计算机图像自动分析技术应用中典型的设备为徕卡和蔡司公司研发的染体核型自动扫描分析系统。如徕卡最顶级的全自动正置荧光显微镜，显微镜的物镜转换和载物台升降等功能均可通过人手和电脑软件控制；也可通过触摸屏控制显微镜的所有电动功能。自动扫描系统是一次性上载120张玻片，用10倍物镜扫描并查玻片中的染体中期分裂相，再 自动转到100倍油镜对出的高质量的染体中期分裂相进行高倍采图。同时，微核与畸变人工智能识别系统，可 以大大提高常规检测和研究的效率，扫描可以在无人看管的情况下在夜间运行，节约了宝贵的日间工作时间。但该系 统仍需人工细胞提取及染制片，且容易受到涂片质量影响而出现大量假阳性结果，系统造价昂贵，维护复杂[_。
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图4染体自动扫描成像系统
在外周血淋巴细胞畸变检测中，人工阅片检测法速度慢、易漏检，适合小样本的即时检测，对涂片质量要求较低；染体核型自动扫描成像系统检测法速度较快，灵敏度更高，适合大批量样本的检测，可以进行数字化管理。两 种检测方法在放射人员外周血淋巴细胞畸变实际检测中可以互补应用。
3.4 荧光原位杂交实验荧光原位杂交(fluo-rescenceinsituhybriflization,FISH)技术是在D N A、RN A 探 针上标记生物荧光素，探针与细胞核及染体特定位置进行原位杂交，并固定于载玻片上，在荧光显微镜下探针部位显出荧光信号。该实验即可检测染体断裂或丢失，也 能判断产生微核或染体畸变的具体染体号码[21-22]，该 方法已在临床细胞组织检测中得到广泛应用。目前成功用 于真核细胞微核及染体畸变检测的D N A探针主要有两类：第一类探针含有D N A重复序列，应用于检测染体着丝粒对应的D N A序列；第二类探针含有染体端粒D N A序列，它主要对染体臂的存在进行检测。若将两种探针的使用相结合，可以较为准确地判断真核细胞微核及畸变染体的组成情况，包括区分游离染体及染体片段及检测各自的数目。在普通荧光原位杂交的基础上，目前国外又研发了彩荧光原位杂交方法。该法能同时检测细胞中的多个特异核酸序列，被广泛应用于肿瘤病理检测、致突变研究等方面[23]。
4真核细胞微核及染体畸变实验的不足与展望真核细胞微核及染体畸变实验在我国的应用经历了技术引进、应用普及、广泛研究、逐渐回落到开辟新天地的一个连续的发展阶段，回顾该实验在我国的发展情况，发现存在较多不足之处。
欠缺原创性工作纵观近20年真核细胞微核及染体畸变实验技术，在我国的应用与发展，一直呈现不断技术创新与领域拓展的形态。但从检测原理到方法应用，绝大多数国内学者都是跟踪研究，新型学说大多是由国外学者首先提出，可见我国学者的原创性工作仍需加强。该 技术在我国检测技术研发、疾病防控等领域都得到
不
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断完善。在医用射线暴露对医护人员血液系统健康的影响、中药银菘香的急性毒性及致突变性研究等报道中都有应用。
4.2欠缺新兴检测技术探索国际上提出了“新微核实验”的概念，完成“新微核实验”多个遗传学损害终点的检测需要多项新兴技术手段的配合运用，如图像分析技术、流式细胞仪检测技术、F I S H技术等，这也对我国科研人员技术水平及实验室硬件技术条件提出了进一步的要求。同 时由于国内许多学者接触真核细胞微核及染体畸变实验的机会有限，对该实验存在认识误区，仅将其作为遗传损害标志物的一种简单检测手段，未能从机理与方法去深人研究与进一步创新。
4.3 检测技术标准化工作滞后由于我国真核细胞微
核及染体畸变检测的标准化操作规程出台较晚，且存在很多急需改进的环节，造成各实验室之间的检测数据波动较大而难以进行针对性比较。目前主要有《放射工作人员职业健康监护技术规范》(GBZ235-2011)、《放射工作人员健康标准》(G B Z-98-2002)以及《放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染体畸变检测与评价》（GBZ/ T248-2014)。
5 小结
根据我国情况，长期低剂量电离辐射对放射工作人员职业健康的影响不可忽视，利用真核细胞微核及染体畸变检测技术对放射人外周血淋巴细胞畸变检测的应用日趋广泛。提高放射工作人员职业防护意识及水平，改善用人单位的放射防护条件，对放射工作人员进行定期职业性健康检查等过程都需逐渐完善。卫生监督管理等相关部门应加强对检测方法的规范化及标准化制定，做好质量控制工作，提高微核及染体畸变实验培训频率，从而为放射工作人员职业健康保驾护航。
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(收稿日期院2020-11-05)
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