作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(3): 597 607 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail:***************
本研究由湖北省重点研发计划项目(2020BBB061)和国家重点研发计划项目(2016YFD100803)资助。
This study was supported by the Key Research and Development Program in Hubei Province (2020BBB061) and the National Key Research and Development Program of China (2016YFD100803).
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通信作者(Corresponding author): 马朝芝,E-mail:********************.edu
第一作者: E-mail: ****************
Received (收稿日期): 2021-02-02; Accepted (接受日期): 2021-06-16; Published online (网络出版日期): 2021-07-14. URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20210714.1250.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14023
黄 成 梁晓梅 戴 成 文 静 易 斌 涂金星 沈金雄 傅廷栋 马朝芝*
华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 / 国家油菜工程技术研究中心, 湖北武汉 430070
摘 要: 天冬氨酸蛋白酶(AP)属于四大蛋白水解酶之一, 在蛋白质加工、信号转导和胁迫反应中发挥着重要作用。甘蓝型油菜是我国重要的油料作物, 利用蛋白质同源性分析, 在甘蓝型油菜中鉴定出154个APs 编码基因, 分别编码典型、非典型和珠心类天冬氨酸蛋白酶。基因结构分析结果表明, 多数BnAPs 基因包含1~4个外显子, 同一类型的天冬氨酸蛋白酶成员之间蛋白质基序(Motif)分布相似。共线性分析表明, 甘蓝型油菜与白菜、甘蓝和拟南芥存在大量的同源基因, 约89%的BnAPs 基因来自于全基因组复制事件。转录水平检测结果表明, BnAPs 基因家族成员在各个组织中均有表达, 其中BnAP30.A05.1/A05.2/C05.1/C05.2、BnAP36.A04/C08、BnAP39.A06/C03在授粉后的柱头显著提高。BnAPs 基因启动子区域顺式元件分析结果表明, 逆境相关的顺式调控元件被显著富集; 进一步利用RT-qPCR 验证了这些富含逆境相关顺式调控元件的基因在逆境(ABA 、NaCl 或4℃)处理后的表达水平显著变化, 推测这些BnAPs 基因可能参与甘蓝型油菜对逆境的响应。进一步和拟南芥同源基因组织表达模式进行比较后发现, 大约有24%的BnAPs 与其同源AtAPs 具有相同的表达模式。本研究为进一步解析天冬氨酸蛋白酶家族在甘蓝型油菜中的生物学功能奠定了基础。 关键词: 甘蓝型油菜; 天冬氨酸蛋白酶; 共线性分析; 表达模式; RT-qPCR
Genome wide analysis of BnAPs gene family in Brassica napus
HUANG Cheng, LIANG Xiao-Mei, DAI Cheng, WEN Jing, YI Bin, TU Jin-Xing, SHEN Jin-Xiong, FU Ting-Dong, and MA Chao-Zhi *
National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / National Engineering Research Center of Rapeseed, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China
Abstract: Aspartate protease (AP) is one of the four major proteolytic enzymes and plays an important role in protein processing, signal transduction, and stress response. Brassica napus is an important oil crop in China. We identified 154 APs coding genes in Brassica napu by protein homology analysis, which encoded typical, atypical, and nucellar aspartate proteases, respectively. Gene structure analysis showed that most BnAPs genes contained 1–4 exons and the motif distribution of the same type of aspartic pro-tease was similar. Collinearity analysis revealed that there was a large number of homologous genes between Brassica napus and Brassica rape , Brassica oleracea and Arabidopsis thaliana , and about 89% of BnAPs genes came from genome-wide replication events. Transcriptional analysis demonstrated that BnAPs gene family was expressed in all tissues. The stigma of BnAP30.A05.1/ A05.2/C05.1/C05.2, BnAP36.A04/C08, and B
nAP39.A06/C03 increased significantly after pollination. Cis -element analysis in the promoter region of BnAPs gene presented that stress-related cis regulatory elements were significantly enriched. We further verify that the relative expression levels of these genes rich in stress-related cis regulatory elements changed significantly after stress (ABA, NaCl, or 4), suggesting that these ℃BnAPs genes may be involved in response to stress in Brassica napus . Compared with Arabidopsis homologous genes, about 24% of BnAPs had the same expression pattern as their homologous AtAPs. This study laid a foundation for further understanding the biological function of aspartic protease family in Brassica napus .
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598作物学报第48卷Keywords:Brassica napus; aspartic protease; collinearity analysis; expression patterns; RT-qPCR
天冬氨酸蛋白酶(aspartate protease, AP)是一类蛋白水解酶, 普遍存在于细菌、真菌、动植物中。不同于动物以及微生物, 植物天冬氨酸蛋白酶具有独特的特异性区域, 可分为典型、非典型以及类珠心3类[1]。大部分典型APs由N端、植物特异性插入物和C端3个部分组成; 类珠心APs类似于在大麦核细胞中发现的核纤维素; 非典型APs序列特征介于典型与类珠心之间。APs在保守的Asp-Thr/ Ser-Gly位点中
含有2个催化活性所必需的天冬氨酸残基[2]。植物APs主要参与蛋白质的降解、细胞程序性死亡以及雌雄配子发育, 也参与植物应对逆境以及生物胁迫等过程[3]。在小麦种子萌发和成熟过程中, 天冬氨酸蛋白酶WAP1和WAP2能降解谷蛋白, 从而为小麦的萌发提供营养物质[4]。水稻APs 成员OsAP65在花粉形成早期绒毡层降解以及花粉管形成发挥着重要作用[5], OsAP25和OsAP27与绒毡层细胞死亡有关[6]。一系列试验证明水稻APs成员OsCDR1 (Constitutive Disease Resistance 1)在植株抵御细菌和真菌的感染中发挥作用[7-8]。拟南芥非典型APs成员PCS1 (Promotion of Cell Survival 1)功能缺失后导致雌雄配子体退化和早期胚胎死亡[9], AtA36和AtA39参与花粉萌发及胚珠发育[10], AtASPG1 (Spartic Protease in Guard Cell 1)参与了ABA介导的抗旱和种子萌发[11-12]。尽管越来越多的植物天冬氨酸蛋白酶基因功能被报道, 然而甘蓝型油菜BnAPs家族成员基因功能还未见报道。通过对甘蓝型油菜BnAPs基因家族成员进行全面的分析, 包括成员鉴定、蛋白结构、Motif、启动子调控元件、表达模式等, 可以有效预测BnAPs基因家族成员的基因功能, 为解析甘蓝型油菜BnAPs生物学功能提供重要依据。
1材料与方法
1.1甘蓝型油菜BnAPs基因家族成员的鉴定
从甘蓝型油菜全基因组信息资源网(cbi. hzau.edu/cgi-bin/rape/)下载甘蓝型油菜“Westar”的序
列信息。分别通过已知的拟南芥蛋白序列进行Blastp[13]以及利用HMMER3[14]搜索筛选候选基因。然后将其蛋白序列提交到NCBI保守结构域数据库(CDD; bi.v/cdd)以及SMART 数据库(bl-heidelberg.de/), 检查BnAPs 结构域的完整性, 删除没有完整APs保守结构域的序列[15-16]。
1.2序列分析
利用ExPASy在线工具ProtParam (web. /protparam/)对BnAPs的蛋白序列进行理化性质分析。利用ClustalW对甘蓝型油菜、拟南芥AP蛋白序列以及已知的AP蛋白序列(Nucellina、CND41、OsAP5/25/37/65/77和GmAP5)进行多序列比对[17-21]。通过MEGAX构建系统发育进化树, 并通过在线网站EvolView (evolgenius.info/)对进化树进行美化。利用MEME(meme-suite. org/tools/meme)来识别BnAPs蛋白的保守Motif [22], 最终通过Tbtools对基因结构以及保守Motif进行可视化展示[23]。
1.3启动子分析
dm500s
从甘蓝型油菜全基因组数据库中提取154个BnAPs基因启动子区域(上游2 kb)。通过PlantCARE (bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/)预测顺式作用元件[24]。同时提交到PlantTFDB 数据库(/)预测候选转录因子结合位点[25]。
1.4共线性分析
利用多重线性分析工具Mcscanx (github. com/wyp1125/MCScanX)分析基因复制事件[26]。通过JCVI (github/tanghaibao/jcvi)分析甘蓝型油菜与拟南芥、甘蓝以及白菜之间的共线性[27]。1.5AtAPs以及BnAPs表达图谱分析
拟南芥不同生育时期的表达图谱数据来自拟南芥转录组数据网站(bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/ i)。甘蓝型油菜不同生育期表达数据来自于甘蓝型油菜转录组信息资源网(yanglab.hzau. edu/BnTIR)。甘蓝型油菜“Westar”花发育不同时期(2 mm和4 mm的花蕾和开花后的花瓣、萼片、花丝、花粉以及授粉30 min后柱头)表达数据均来自本实验室之前所测的转录组。
1.6材料收集以及处理条件
植物试验材料为欧洲春油菜品种“Westar”。将发芽后的油菜幼苗移栽至油菜水培盒中, 在25℃光照16 h温室中生长。将1周的幼苗分别置于200 mmol L–1 NaCl、100 μmol L–1 ABA以及4℃条件进行处理, 并以清水处理作为空白对照, 对它们进行连续的光
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第3期黄成等: 甘蓝型油菜BnAPs基因家族成员全基因组鉴定及分析 599
照并确保根部吸收溶液。分别处理1、4、8、12 h, 每个处理组合包含10株幼苗, 设置3个重复, 处理完后整株取样。此外取大田当天开花未授粉柱头和授粉30 min后的柱头, 每个样品取30个柱头, 设置3个重复。将所有样品取样后迅速冷冻在液氮中, -80℃保存备用。
jis标准1.7RNA提取和RT-qPCR分析
利用SV Total RNA Isolation System (Z3100, Promega)试剂盒提取植物组织RNA, 利用Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser (RR047, TaKaKa)反转录获得cDNA, 反转录产物稀释50倍作为模板。使用Perl Primer设计引物, 具体引物序列信息见附表1, 其中Actin为内参基因。RT-qPCR 反应体系为SYBR Realtime Mix 10 μL, 包含上下游引物各0.8 μL、cDNA模板8.4 μL。RT-qPCR反应程序为95℃预变性3 min; 95℃变性10 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 共45个循环。每个处理3个生物学重复, 并使用2–ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。
2结果与分析
2.1甘蓝型油菜BnAPs基因家族成员鉴定和进化树构建
参考拟南芥AtAPs基因家族蛋白序列, 在甘蓝型油菜基因组中确定了154个BnAPs成员。根据它们在甘蓝型油菜染体上的顺序对这154个BnAPs 基因进行重命名。在甘蓝型油菜中, APs蛋白序列的长度在
301 aa (BnAP34.C01)到1576 aa (BnAP25.C04)之间。此外, 还分析并提供了154个APs蛋白的理化性质, 包括分子量、等电点、亚细胞定位等(附表2)。为研究系统发育关系, 本研究用154个BnAPs和62
图1甘蓝型油菜和拟南芥APs蛋白系统发育树
Fig. 1 Phylogenetic relationships of APs proteins in Brassica napus and Arabidopsis thaliana
有源滤波器不同的颜表示APs家族的不同亚组。
The different colors indicate different subgroups of the APs family members.
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600作物学报第48卷
个AtAPs以及8个已知APs蛋白共同构建了系统发育树[17-21]。系统发育分析结果表明, 这154个BnAPs 蛋白可分为3类: 11个具有植物特异性插入蛋白(PSI)的典型BnAPs, 8个在高度保守的QCDYE和GCGYDQ序列中含有2个半胱氨酸的类珠心BnAPs, 其余135个BnAPs为非典型AP (图1)。
2.2甘蓝型油菜BnAPs基因结构及蛋白质保守基序分析
甘蓝型油菜BnAPs家族成员的基因结构分析结果表明, 110个BnAPs基因的外显子数目为1~4个, 其中, 典型BnAPs基因只有1个外显子; 非典型BnAPs基因外显子数目在1~13之间, 在亚家族之间的外显子数目相似; 除BnAP10.C06含有1个外显子外, 多数类珠心BnAPs基因有9个外显子(图2)。进一步利用MEME软件分析BnAPs家族成员保守的蛋白质基序发现, 154个BnAPs成员中共预测出20个保守的蛋白质基序(Motif), 每个Motif包含10~50个氨基酸(图2和附图1)。其中, Motif 1~Motif 10几乎存在于所有BnAPs成员中; Motif 14、Motif 15、Motif 18和Motif 20在典型BnAPs中显著富集; Motif 17和Motif 19仅在非典型BnAPs成员中显著富集。
2.3甘蓝型油菜BnAPs在染体上的分布以及共线性分析
甘蓝型油菜有19条染体, 在各个染体上均分布有BnAPs基因, 但BnAPs的数目在染体间差异很大, 甘蓝型油菜A基因组和C基因组上分别分布有74个和80个BnAPs基因。就单个染体而言,
图2甘蓝型油菜BnAPs的系统进化树、基因结构和Motif组成分析
Fig. 2 Phylogenetic tree, gene structure, and motif composition analysis of the AP family in Brassica napus . All Rights Reserved.
第3期黄成等: 甘蓝型油菜BnAPs基因家族成员全基因组鉴定及分析 601
A07染体最少, 只包含2个, C01和C05染体最多, 包含10个(附图2)。甘蓝型油菜基因组内共线性分析结果显示, 118对BnAPs存在共线性关系, 其中A08染体与A09染体、A08染体与C08染体以及A04染体与C04染体之间的共线性基因对最多, 均含有8对同源基因。进一步分析发现, BnAPs基因全部来自于基因复制, 其中139个BnAPs 来自全基因组复制/片段复制, 6个来源于串联重复(Tandem Duplication), 5个来自于散在重复(Dispersed Duplication), 4个来自于不相连重复(Proximal) (附表3)。甘蓝型油菜是异源四倍体, 由白菜和甘蓝在自然条件下杂交而成。共线性分析表明, 在154个BnAPs中, 110个与拟南芥存在共线性关系, 130个与白菜存在共线性关系, 140个与甘蓝存在共线性关系(图3-B)。进一步对拟南芥AtAPs基因在甘蓝型油菜中的同源基因进行统计发现, 88%的拟南芥APs基因在甘蓝型油菜中有2个以上同源基因, 其中AtAP30在甘蓝型油菜中有8个同源基因。表明, BnAPs基因家族在芸薹属多倍化事件中得到显著的扩张。
2.4甘蓝型油菜BnAPs基因表达模式分析
为进一步分析BnAPs的功能, 在甘蓝型油菜BnTIR数据库(yanglab.hzau.edu/BnTIR)中获得144个BnAPs基因的组织表达情况, 并构建表达数据热图(图4-a)。总体而言, 144个BnAPs基因中分别有52、41、22、71和57个在根、茎、叶、花以及种子中高表达。按照BnAPs基因的表达模式可以将其大致分为3类: 第1类是在不同组织中均高表达, 例如BnAP60.A08/A09.2/C08.1; 第2类是在多数组织中均有表达, 但是在特定组织中表达量高, 例如BnAP14.C02.2在各组织中均有表达, 而在花中表达量最
历史唯心主义
高; 第3类是仅仅在1种或是2种组织种特异表达, 比如BnAP61.A03/A09/C03、BnAP62.A03/C04仅在种子中表达。相比较其他部位, 有更多的BnAPs成员在花中高度表达, 所以我们进一步分析这些基因在开花后的花瓣、萼片、花丝、花粉以及2 mm和4 mm花蕾组织的表达情况。根据表达部位可以将这些基因分为4类(图4-b): 第1类主要在成熟花瓣、花丝以及萼片中高度表达, 例如BnAP31.A04、BnAP42.A08等; 第2类主要在成熟花粉中高度表达，例如B n A P36.A08、BnAP30.A05.1等; 第3类主要在2 mm花蕾中高度表达, 例如BnAP25.A04、BnAP1.C09等; 第4类主要在 4 mm花蕾中高度表达, 例如BnAP29.A04、
图3甘蓝型油菜BnAPs基因家族基因组内共线性关系以及与芸薹属植物共线性分析
Fig. 3 Collinearity analysis of BnAPs gene family in Brassica napus and Brassica plants
A: 灰区域表示甘蓝型油菜基因组中的所有共线性区域, 红线条表示共线性的BnAPs基因对, 基因在染体上的位置显示在每个
染体的顶部。B: 灰线条背景显示甘蓝型油菜和其他植物基因组中的共线区, 彩线条区突出了与不同物种间的共线性同线APs结缔组织增生
基因对。
集效应A: the gray lines indicate all synteny blocks in B. napus genome, and the red lines indicate duplicated BnAPs gene pairs. B: the gray line background shows the collinear regions in the genomes of Brassica napus and other plants, and the color line region highlights the collinear APs gene pairs with different species.
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