中华鲟热休克蛋白hsp30基因cDNA的克隆及其在高温胁迫下的表达分析 司凯歌; 江南; 张海耿; 周勇; 刘文枝; 曾令兵; 倪琦; 范玉顶
【期刊名称】《《淡水渔业》》
【年(卷),期】2019(049)006蝮蛇抗栓酶
【总页数】7页(P20-26)
【关键词】中华鲟(Acipenser sinensis); 热休克蛋白; HSP30; 表达特征; 温度胁迫
【作 者】司凯歌; 江南; 张海耿; 周勇; 刘文枝; 曾令兵; 倪琦; 范玉顶
【作者单位】水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学) 上海201306; 中国水产科学研究院长江水产研究所 武汉430223; 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所 上海200092
【正文语种】中 文
【中图分类】S917.4
海音寺潮五郎
热休克蛋白(Heat shock proteins,HSP)是普遍存在于各类生物体中的一类应激蛋白，具有分子伴侣、抗应激、调节细胞凋亡、抗氧化以及参与机体免疫等生物学功能[1]。当生物体受到环境中各种物理、化学等因素刺激时就会产生应激反馈从而合成该类蛋白质，以增强自身抵抗力，降低外界刺激对机体的伤害。根据分子大小、结构和功能，HSP通常被分为6个家族，即HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子HSP(sHSP)[2]。HSP30 是属于sHSP家族的重要成员，蛋白序列包括N末端序列(NTS)，α-晶状体蛋白结构域(ACD)，C末端序列(CTS)和C-末端延伸(CTE)，在不同物种之间具有高度的保守性。HSP30具有sHSP 家族的显著特点，可以形成分子质量为100～800 ku的寡聚体来发挥其分子伴侣作用[3]。在两栖动物、爬行动物和鸟类中已有hsp30基因的报道，而在鱼类中hsp30研究相对较少，已经报道的有大黄鱼[3]、虹鳟[4]、金鱼[5]等，中华鲟中尚未见该基因的报道。 热休克蛋白是辅助蛋白质合成、折叠和预防应激诱导的蛋白质聚集的分子伴侣。热休克诱导的HSP30的相对表达水平在热休克恢复期间持续存在，它们可能在损伤蛋白质的聚集中发挥作用[7]；而在两栖动物和鱼类HSP30研究中发现，HSP30具有抑制未折叠蛋白聚集的功能[8,9]。细菌的感染也会诱导鱼类hsp30基因的表达，例如嗜水气单胞菌可引起麦鲮出
血性败血症，在感染后的几个小时内肝脏、肾脏和脾脏中的hsp30 mRNA表达水平均上调[10]。
中华鲟(Acipenser sinensis)属鲟形目鲟科鲟属，是一种大型溯河产卵洄游型鱼类，由于水利水电工程建设、航运、污染和过度捕捞等人类活动的影响，其生存环境恶化，数量急剧减少，物种处于极度濒危状态，为国家I级水生保护动物[11]。温度是影响鲟健康养殖的一个重要因素，高温季节养殖鲟易患各种严重的细菌性疾病，给鲟鱼养殖业带来巨大经济损失[12,13]。本实验克隆、鉴定在温度应激中起重要调控作用的中华鲟hsp30基因cDNA，分析其序列特征和系统进化关系，并研究其在高温胁迫下的组织表达特征，为研究温度胁迫下该基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验鱼
实验用中华鲟来源于中国水产科学研究院长江水产研究所太湖养殖基地，平均体重为(20±3) g。试验之前暂养于水温为(20±0.5) ℃的室内循环水养殖系统，并按时投喂饲料，暂养7日后开始实验。
1.2 核酸提取
实验鱼暂养7日无任何异常后，随机取3尾作为对照组；另将一批暂养鱼直接转入28 ℃循环水系统作为高温胁迫试验组。在高温胁迫后的0、6、12、24和48 h各取样本鱼3尾，总共15尾，收集脾脏样品置于DNAzol(Invitrogen)中，同时分别收集对照组和试验组的肝、肾、脾、心、肠、脑和皮肤样品置于Trizol(Invitrogen)中，并按试剂说明书提取DNA和RNA。使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(TaKaRa，大连)合成cDNA模板，反转录引物为Random 6 mers (50 μmol/L)1 μL,样品RNA 8 μL,总体系20 μL,具体操作按说明书进行。 1.3 hsp30基因cDNA的克隆
根据实验室测定的中华鲟转录组中hsp30基因的部分序列设计RACE巢式引物5′RACE-1、5′RACE-2、3′RACE-1、3′RACE-2(表1)。用SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit(Clontech)制备5′RACE和3′RACE末端的cDNA，具体操作按说明书进行。分别以5′RACE和3′RACE cDNA为模板进行PCR扩增。具体扩增条件为：94 ℃变性5 min；94 ℃ 变性30 s，66 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸2 min，5个循环；94 ℃ 变性30 s，64 ℃ 退火30 s，
72 ℃ 延伸2 min，25个循环；72 ℃ 延伸2 min。反应结束后取1μL PCR产物稀释50倍作为第二轮PCR的模板，相同条件下进行第二轮PCR反应。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL EB)电泳检测，回收产物送测序公司测序。根据得到的5′RACE和3′RACE末端的cDNA序列，设计一对基因特异性引物hsp30-1-F/ hsp30-1006-R(表1)，以中华鲟基因组DNA为模板，扩增hsp30全长基因组序列。
1.4 HSP30氨基酸序列分析及系统进化分析
将测序所得核苷酸序列及相应的氨基酸序列用BLAST程序比对分析，用CLUSTAL软件对不同物种HSP30结构域进行比对分析，系统进化树的构建使用MEGA6.06软件进行对比分析。
1.5 中华鲟hsp30的定量表达分析
根据获得的中华鲟hsp30序列设计荧光定量引物hsp30-qF和hsp30-qR(表1)，以中华鲟不同组织(肝、肾、脾、心、肠、脑和皮肤)以及高温应激后各组织的不同时间点(0、6、12、24和48 h)cDNA 为模板进行qRT-PCR定量分析。每个样品重复三次，以中华鲟β-actin基因作
为内参基因，β-actin引物为β-actin-F和β-actin-R(表1)。通过Rotor-Gene 6000实时PCR系统(Qiagen)进行扩增。qRT-PCR混合物包括：1 μL稀释的cDNA样品，10 μL Power2×SYBR实时PCR预混合物(BioTeKe)，上下游引物各1 μL(0.4 μmol/L)和7 μL H2O组成。qRT-PCR反应循环条件：95 ℃变性5 min,95 ℃变性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s,40个循环，72 ℃延伸5 min。通过2-△△ct方法计算hsp30基因的相对表达量，实验数据以平均值±标准差(SD)形式呈现。
表1 本实验所用到的引物序列Tab.1 Sequences of primers used in the present study引物序列用途5′RACE-1TGGCCGTTAGAAACCGGCACGRACE-PCR5′RACE-2AGTGTGTCGGGGCAGGTCGATT3′RACE-1TGGCCTTGGACGTCCGGGAT3′RACE-2TCGACCTGCCCGACACACTHsp30-1-FCAAGACTAGAAGAGGTATTTGDNA-PCRHsp30-1006-RCGCTGCGTAAACAAATGTATTTGβ-actin-FGATCGGCAATGAGCGTTTCCqRT-PCRβ-actin-RACGGTGTTGGCATACAGGTCHsp30 - qFCAGTGAAACTGGTGGGGAGGHsp30 - qRGAAGGTTAGTGTGTCGGGGC
1.6 数据分析
实验所获得的数据采用SPASS17.0进行生物统计学分析，使用t检验进行差异显著性检验：P<0.05，差异显著，差异显著性用*表示。
2 结果
2.1 中华鲟HSP30基因cDNA克隆
通过RACE技术获得了1 037 bp的中华鲟hsp30基因全长cDNA序列，其ORF 636 bp(39～677 bp)，编码211个氨基酸，含有小分子热休克蛋白基因的α-晶状体结构域(ACD)，5′端非编码区38 bp(1-38)，3′端非编码区363 bp(678～1 037 bp)。根据获得的中华鲟hsp30全长cDNA序列，设计一对基因特异性引物hsp30-1-F、hsp30-1006-R，以中华鲟基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶及测序鉴定，所得序列与在cDNA模板中扩增的结果完全一致，表明中华鲟hsp30基因不含有内含子。该序列已提交至GenBank(登录号：MK573626)。
2.2 HSP30氨基酸多重序列比对和结构分析奥氏体
张翼德大闹长坂桥
将中华鲟HSP30(A.sinensis)与椋鸟(S.vulgaris,XP_014740900.1)、非洲爪蟾(X.laevis,NP_
00116 5977.1)、斑马鱼(D.rerio,NP_001092897.1)和鳄鱼(A.mississippiensis,XP_014460159.1)的HSP30氨基酸序列进行多序列比对。结果表明，这些物种均含有HSP30蛋白的典型结构，包括N-末端序列(NTS)、α-晶状体蛋白结构域(ACD)、C-末端序列(CTS)和C终端扩展(CTE)(图1)。HSP30的ACD中丝氨酸磷酸化位点在中华鲟、非洲爪蟾、斑马鱼和鳄鱼氨基酸序列均都存在，而在椋鸟氨基酸序列中未发现此位点。HSP30的CTS中的I-X-I基序在非洲爪蟾、斑马鱼和鳄鱼氨基酸序列中是I-P-I，而在中华鲟和椋鸟氨基酸序列中为V-P-I。
图1 中华鲟HSP30氨基酸序列与其他物种序列比对Fig.1 Multiple amino acid sequences alignment of HSP30 in A.sinensis and comparison with other vertebrates
α-晶体蛋白结构域(ACD)用单下划线表示，C-末端延伸用双下划线表示。N-末端序列(NTS)用最上行星号表示，而C-末端序列(CTS)用最上行虚线表示。在CTS中用加粗的IXI基序涉及二聚体/寡聚体形成。ACD中的丝氨酸是潜在的MAPKAPK-2磷酸化位点，用阴影表示。下行“*”表示一致的氨基酸，“:”代表保守氨基酸取代，“.”代表半保守取代。
项目成本管理论文2.3 中华鲟HSP30系统进化分析
将中华鲟HSP30氨基酸序列与其它非哺乳类脊椎动物HSP30氨基酸序列构建系统进化树(图2)。结果表明，中华鲟HSP30与小体鲟和雀鳝等鱼类聚为一个分支，该分支再与两栖类和爬行类形成的分支聚在一起，鸟类HSP30形成一个单独的分支。中华鲟HSP30氨基酸序列与小体鲟和雀鳝的HSP30氨基酸序列相似性较高，分别为79%和51%，与爬行类、两栖类和鸟类的相似性较低，在30%～35%之间。
图2 中华鲟及其他物种HSP30系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on putative amino acid residues HSP30 between A.sinensis and other species
男子做前列腺电切术后死亡2.4 中华鲟hsp30基因的组织表达模式
hsp30基因在健康中华鲟的肝、肾、脾、心、肠、脑和皮肤组织中的表达情况。结果表明：hsp30基因在检测的中华鲟7种组织中均有表达，其中在皮肤中的表达量最高、肝脏次之，且均显著高于该基因在肾脏中的表达量；hsp30基因在其他5种组织脾、肾、心、脑和肠中的表达量均较低(图3)。
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