赵娟;兰海燕
【摘 要】[Objective]To analyze the expression of BC1 in different tissues under various abiotic stresses in A. thaliana, [Method]Vigorous growth A. thaliana plants were treated with cold (4℃) , heat (37℃) , salt (200 mmol/L NaCI) and drought (21.5％ PEC which is isosmotic to 200 mmol/L NaCl solution) stresses, the expression levels of BG1 in different tissues (leaf, bolting, flower, silique) were detected by semi - quantitative RT - PCR method, and 28S rRNA was used as intemal reference. [ Result] Results showed that : ( 1) In unstressed plants, the expression levels of BG1 in different tissues were diverse, which were high in flower and silique, while low in leaf and bolting . (2) Stresses changed the expression pattems in different tissues . In leaves , the expression levels of BC1 were reduced under various treatments except for salt stress; in boltings , which were decreased except for cold stress; in flowers, the expression was significantly stimulated under NaCl treatment, while PEG and heat stresses reduced its expression level. The expr土耳其开局
ession levels of BG1 in siliques under PEC stresses increased slightly, only at 37 ℃ treatment and salt stress showed a slight decrease. [ Conclusion]In unstressed plants, the expression levels of BC1 in different tissues were different, and under stressed condition, the expression pattern changed in some extent .%[目的]研究拟南芥β-1,3-葡聚糖酶基因(BG1)在不同组织及胁迫条件下的表达规律.[方法]研究以拟南芥为材料,以28S rRNA为内参,利用半定量RT-PCR法研究了低温(4℃)、高温(37℃)、NaCl胁迫(200 mmol/L)和与之等渗的PEG(21.5%)干旱胁迫处理在不同组织(叶、薹、花、果)ep BGl的表达情况.[结果](1)正常植株中,BG1在不同组织的表达量不同:花、果>叶>薹.(2)胁迫处理对BGI的表达量有影响.在叶中,盐胁迫不影响其表达,其他处理都使其表达量减少;在薹中,除低温处理使其表达量明显增加,其他情况的表达都减少,37℃和干旱胁迫后几乎不表达;在花中,NaCl胁迫处理后表达量明显增加,PEG处理及高温胁迫后表达量下降;在果实中,BGI在PEG胁迫后表达量稍有增加,而37℃和盐胁迫表达稍有下降.[结论]在正常植株中,BG1的表达具有差异性;BG1对各种胁迫处理的响应不同.
【期刊名称】《新疆农业科学》
【年(卷),期】2011(048)004
【总页数】7页(P712-718)
【关键词】拟南芥;β-1,3-葡聚糖酶基因(BG1);半定量RT-PCR;非生物胁迫
【作 者】赵娟;兰海燕
【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院,新疆生物资源与基因工程重点实验室,乌鲁木齐,830046;新疆大学生命科学与技术学院,新疆生物资源与基因工程重点实验室,乌鲁木齐,830046
【正文语种】中 文
【中图分类】贝尔实验室S188+.2
0 引 言
【研究意义】β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)又称昆仑多糖酶或胼胝质酶,是动植物中一种重要的水解酶。它不仅参与植物的多种生长发育过程,还可以用于酒类加工,饲料加工,多糖改型增溶以及酵母原生质体制备等方面,具有极高的应用价值[1]。随着生物技术的迅猛发
郭庚茂简历展,具有生防价值的β-1,3-葡聚糖酶以及其转基因的研究也受到了广泛的重视并取得了较大的进展。通过研究,为推测拟南芥β-1,3-葡聚糖酶基因(BG1)的功能及定位并更好地认识和利用葡聚糖酶基因提供理论依据。【前人研究进展】20世纪70年代初,Van Loon等[2](1985)通过病原物入侵植物所诱发的防卫反应证明β-1,3-葡聚糖酶亦是一种病程相关蛋白(PR),与植物的防御体系有关。从20世纪60年代起,十几种植物中的多种β-1,3-葡聚糖酶基因已被研究清楚,已知的β-1,3-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第十七家族。根据其作用方式不同,β-1,3-葡聚糖酶被分为外切酶和内切酶[2];根据其等电点、定位、mRNA表达模式及序列的同源性等特点,则可将其至少分为三种不同类型,其中存在于液泡中的Ⅰ型碱性酶因体外具较强抑菌活性,目前研究的较多[3]。β-1,3-葡聚糖酶在高等植物内广泛分布,不仅是某些组织的组分,而且参与许多生理过程,在植物正常发育中发挥重要作用[2]。葡聚糖酶在整株植物中的分布是不均衡的,其在花的萼片中的表达明显高于花瓣,而在雄蕊和心皮中则检测不到该酶的表达[4]。另外,还有结果表明,碱性β-1,3-葡聚糖酶也可在烟草组培组织中积累[5]。β-1,3-葡聚糖酶基因在受到生物及非生物因素刺激之后,一般在几个小时内便可观测到其表达变化[6,7]。【本研究切入点】对不同组织中不同胁迫条件下BG1基因的表达分析目前报道较少。【拟解决的关键问题】实验通过半定量RTPCR的方法,研究拟南芥BG1基因在不同组织(叶、薹
、花和果)及各种非生物胁迫处理(高低温、盐和干旱)条件下的表达情况。探讨BG1在不同组织的差异表达及对非生物胁迫条件产生的不同响应。
1 材料与方法
大数据风控的营销1.1 材 料
1.1.1 材料种植
将拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)Columbia生态型种子(本实验室繁殖留种)播于珍珠岩、蛭石(1∶3)基质中,置于22℃,16 h光照/8 h黑暗及60～100 μ mol/(m2·s)的光照强度下培养。植株生长期间2～3周用1/2 MS浇灌补充营养[8],中间补给充足水分。待拟南芥植株培养2个月且有足够多的薹、花和幼嫩果实生物量时用于后续实验。
1.1.2 材料处理
选取同一时期长势好的拟南芥植株,分别进行低温(4℃)、高温(37℃)、PEG和NaCl胁迫处理。具体方法如下:温度胁迫时,将植株置于有光照的4℃或37℃培养箱中处理24 h。渗透或 盐溶液胁迫时,用200 mmol/L NaCl及与其等渗的PEG溶液(21.5%)淋透基质后并将花盆浸在相应浓度溶液中[9～11]处理24 h。实验结束后,每处理分别采集0.1 g叶、薹、花、果各三份,立即投于液氮中以用于随后的RNA提取。
1.2 方 法
1.2.1 序列分析
由已知的拟南芥BG1基因,从NCBI上获得其它物种BG1的核酸及蛋白序列,对其进行分析后构建系统进化树。序列比较及系统发育分析采用Clustal X软件,利用MEGA 4.0的NJ(邻近法)构建系统发育树,自举测试均为1 000个重复[12,13]。另外,利用ExPasy蛋白组学系统中的Compute pI/MW软件预测拟南芥葡聚糖同工酶的等电点及蛋白分子量。
1.2.2 总RNA的提取
RNAprep植物总RNA提取试剂盒(天根公司)法提取拟南芥各种组织的总RNA,实验步骤参照说明书。DNase I消化排除基因组污染。用ND-1000定量并测OD260/OD280的比值估计总RNA纯度。在1%琼脂糖凝胶上电泳检测总RNA的完整性。
1.2.3 cDNA第一链的合成
建筑速写技法取等量不同组织的总RNA,采用宝生物工程(大连)有限公司的反转录酶M-MLV,Oligo-d(T)15为引物合成cDNA第一链。实验步骤参照说明书进行。反转录产物以15 μ L/管分装保存在-20℃冰箱中,备用。
1.2.4 拟南芥BG1和28S rRNA基因的半定量RT-PCR扩增
根据拟南芥BG1序列(NM115587)设计核心区段的特异引物。BG1-上游:CTCC GAGAGTC TTATCCACC;BG1-下游:ACTATTTCCAATGATGCGCC。拟南芥 28SrRNA:At28S-上游:GCCGACCCTGATCTTCTGTGA;At28S-下游:TACCCAAGTCAGACGAACGATT。引物由上海生物工程公司合成。
PCR采用20 μ L反应体系,程序如下:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸20 s,进行一定数量循环(内参为20个循环,目的基因为33个循环);72℃延伸5 min。
在进行半定量RT-PCR过程中,通过反复调整PCR产物量使内参基因在琼脂糖凝胶上亮度达到一致,再将同一组织不同胁迫处理样品的BG1基因PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,GE
LVIEW染,紫外灯照相。利用灰度扫描的方法计算样品和内参的比值进行数据统计。
1.2.5 数据分析
利用Champlhemi Basic化学发光及荧光成像系统的LANE 1D软件进行灰度扫描,求同一张凝胶电泳图上的IOD(BG1/28S)=IOD(BG1)/IOD(28S),用GraphPad Prism 4.0软件作图及数据分析,Oneway ANOVA进行差异显著性检验,Tukey多重比较确定各样本间差异显著性水平。
生产力三要素2 结果与分析
2.1 β-1,3-葡聚糖酶同工酶的序列分析
2.1.1 拟南芥BG1与其他物种的比较
拟南芥BG1核酸序列在NCBI中进行相似性比对,由此得到其它物种来源的期望值小于e-10的葡聚糖酶基因序列 22个,其同源性的高低排序分别是:拟南芥 BG1(NM 115587)、毛果杨(XM 002323289)、拟南芥BG3(NM 115584)、芥菜(DQ359125)、银灰杨(AF230109)、欧
洲山毛榉(DQ124218)、白杨(CT029661)、菘蓝(EU684742)、长喙田菁(AB242268)、荔枝(GU002671)、葡萄(XM 002277133)、菜心(AY836001)、甜橙(AJ000081)、柑橘(EF121321)、木薯(EF035080)、甘蓝(EF484879)、玉米(DQ244526)、烟草(M60464)、截形苜蓿(BT051571)、油菜(X77990)、欧洲草莓(AB106653)及落花生(HP019855)。利用MEGA 4.0做出了不同物种的β-1,3-葡聚糖酶基因的系统发育树模型。每一个基因表示为:物种名称(基因登录号),每一分支点上的数字为自举值。其中树图中实线框中为拟南芥BG1基因。从不同物种β-1,3-葡聚糖酶基因系统发育树可以看出,除去甜橙和柑橘,7种十字花科的关系比较近(图1虚线框内)。图1
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议