定量PCR加样操作流程

QPS-201加样流程和Step One Plus仪器的仪器操作

要准备的东西：

1.八排管和盖子

2.96孔细胞培养板

3.移液器：10ul,20ul,100ul,200ul。

4.头10ul,20ul,100ul,200ul或者300ul。

5.200ul和600ul的PCR管。

6.试剂：QPk-201，上下游引物，cDNA，去RNA酶的PCR水

7.注意事项：

A.引物的储存浓度100nm，工作浓度：5-10nmol,引物要过量，上下游引物要先混匀在一起，然后再加。内参actin和目标基因的引物都要混匀。混匀后的引物可用半个月，用时要反复混匀，水样的东西混20下，油状的（酶）东西至少要混30下。

B.试剂配总管用，cDNA和酶mix配一管，引物和水配一管。混匀之后，再分别加到管子里。为什么试剂要配总管呢？cDNA模板量很少，所以加多加少对实验影响很大，酶加10ul，样多，少量的东西要想混匀，必须放在大量的东西里这样再去混匀，就可以使每个管子里的样品都能保证是一致的。

C.内参和目标基因都要跑3个复孔，取平均值，差异CT值要在0.5之内，如果Ct值>0.5，结果就不可信，要重新再做。

（一）QPk-201加样流程：

用QPk-201做样品体系是20ul的。

cDNA :2ul

PCR水：6ul

目标基因STOB1，样品六个，编号：1,2,3,C5，C6，C7

如何计算是关键：

6个样品，每个样品配一管，再分6次加，但是要考虑都损失，所以要多加10%的量，以避免最后没得加了。

cDNA和酶配一管：

cDNA:2×6×1.1=13.2ul

酶Mix:10×6×1.1=66ul，在总管里吹打30次混匀，取12ul。

引物和水配一管：

引物：2×18×1.1=39.6ul

PCR水：6×18×1.1=118.8ul，在总管里吹打20次混匀，取8ul。

配完之后要混匀。

剩下的就是加样，贴在一侧的壁上，加样时，先吹打，再吸，贴壁打到底，按着不松，把

移液器收回来。加一个样品，就换一个头。

加另一管的时候，把管子反过来，再在这一侧壁上加管，的就不用换头了。

这个加样的步骤一般是在碎冰上操作的，试剂一定要放在冰上的。

加完之后，轻轻的盖上盖子，放在离心机里离心，让试剂都落到管子底部去。

离心完之后，就可以放到定量PCR仪的黑的96孔板子上了，然后打开机器，放进去，开始设置了。

本文发布于:2024-09-22 01:56:40，感谢您对本站的认可！

标签：样品引物加样试剂

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