马红;刘宇;汪亮;王文涛;吴赛辉;何鑫淼;刘娣
【摘 要】Min pig is a local pig breed in Northeast China.It has been well-adapted to the local cold weather,but few genes related to its environmental adaptation have been studied.For studies about environmental adaptation of Min pig on molecular level,it is important to have proper refer ence genes for quantification of gene expression by quantitative Real-time PCR.In this study,12 reference genes (B2M,ACTB,RPL11,RPL4,YWHAZ,GAPDH,HPRT1,SDHA,HMBS,IDH3B,TUBB2B and TBP1) were evaluated for their potential as the reference gene in Min pig peripheral blood mononuclear cells under different temperatures.Blood samples were collected from 3 Min pigs which were under-25,5,10 and 30 C,respectively.Mononuclear cells were separated using density gradient centrifugation.Statistical algorithms including geNorm,Normfinder and BestKeeper were employed to assess the stabilities of these genes.Analysis of geNorm and Normfinder revealed that all these 12 genes were highly stable.However,ACT
王立军自白
B,GAPDH,SDHA,HPRT1,TBP1 and YWHAZ genes (SD＜1) were found to be more stable than other six genes (SD＞1),of which TBP1 was the most stable one using BestKeeper program.To summarize,ACTB,GAPDH,SDHA,HPRT1,TBP1 and YWHAZ genes were suitable to be the reference genes,with TBP1 was the best one.%民猪是能够适应东北地区寒冷环境的地方猪种,但目前对其环境适应性相关基因的研究较少,也没有确定适合此研究所需的实时荧光定量PCR的内参基因.因此,本试验通过研究常用的12个内参基因(B2M、ACTB、RPL11、RPL4、YWHAZ、GAPDH、HPRT1、SDHA、HMBS、IDH3B、TUBB2B和TBP1)在不同环境温度下民猪外周血单核细胞中的表达稳定性,旨在确定合适的内参基因进行相关研究.分别在-25、5、10和30℃采集3头民猪耳静脉血分离出单核细胞,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3种软件分析12个候选内参基因的Ct值,筛选出表达稳定的基因作为内参基因.经geNorm和NormFinder计算获得各候选基因的M值发现,12个候选基因的表达均相对稳定,而BestKeeper的分析则显示ACTB、GAPDH、SDHA、HPR T1、TBP1、YWHAZ基因的SD值均＜1,可用作本研究条件下的内参基因,而另外6个基因SD值则＞1,不符合作为内参基因的标准.综合3种分析的结果,在本研究条件下,TBP1基因的稳定性最高,ACTB、GAPDH、SDHA、HPRT1和YWHAZ基因也符合作为内参基因的标准,都可研究在不同环境温度下民猪外周血单核细胞中基因表达时作为内参基因.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2017(044)012
国模王真
【总页数】8页(P3426-3433)
【关键词】民猪;外周血单核细胞;环境温度;实时荧光定量PCR;内参基因
【作 者】马红;刘宇;汪亮;王文涛;吴赛辉;何鑫淼;刘娣
【作者单位】黑龙江省农业科学院畜牧研究所,哈尔滨150086;黑龙江省农业科学院畜牧研究所,哈尔滨150086;黑龙江省农业科学院畜牧研究所,哈尔滨150086;黑龙江省农业科学院畜牧研究所,哈尔滨150086;黑龙江省农业科学院畜牧研究所,哈尔滨150086;黑龙江省农业科学院畜牧研究所,哈尔滨150086;黑龙江省农业科学院畜牧研究所,哈尔滨150086
中央电大形成性考核
【正文语种】中 文
四神瓦当
【中图分类】Q781
民猪是中国重要的地方猪种，随着近年来地方畜禽品种遗传资源研究的深入，对民猪特殊生物学特性的遗传基础研究也越来越多。民猪起源于寒冷的东北地区，具有较好的抗寒性，加强对民猪抗寒能力相关基因的研究、揭示其机理，对民猪资源的保护和利用具有重要意义。
在基因研究中，实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性好、自动化程度高的特点，是研究基因表达最常用的手段[1]。但因其过于灵敏，需要通过稳定表达的参考基因来标准化靶基因的表达结果，降低试验过程中的误差和变化，进而准确的获得靶基因表达情况[2]。目前可用作内参基因的看家基因很多，但在不同的试验条件下，不同看家基因的表达稳定性也会发生变化，需要根据试验进行进一步选择。目前，针对家畜环境适应特性的分子机理所开展的研究还不多，也没有专门进行适用于猪在不同环境温度下基因表达研究的内参基因筛选。因此，本研究选择黑龙江省哈尔滨地区室外饲养的民猪为试验动物，采集其耳静脉外周血，并选择了12个常用看家基因作为候选基因，检测其在试验条件下的表达情况，并通过geNorm、NormFinder和Best-Keeper软件进行分析，筛选出表达稳定的看家
基因，作为研究民猪在不同温度环境下外周血单核细胞(PBMC)中的基因表达分析的内参基因。
1.1.1 样本采集 选择5月龄、体重约50～60 kg、性成熟的健康民猪3头，饲养于室外半敞篷环境，正常饲喂且自由饮水，室外温度低于0 ℃后，饲喂热食热水，分别在环境温度达到-25、5、10和30 ℃时用抗凝采血管采集民猪耳静脉外周血，轻轻摇动采血管使血液与抗凝剂混合，1 h内将采血管带回实验室。
1.1.2 主要试剂与仪器 聚蔗糖—泛影葡胺白细胞分层液购自索莱宝科技有限公司；Trizol、PCR SuperMix Ⅲ均购自Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix(2×)购自北京康为世纪生物科技有限公司；溴化乙锭购自TaKaRa公司。
实时荧光定量PCR仪(Roche LightCycler480 Ⅱ)；DYY-12C电泳槽购自北京市六一仪器厂；凝胶成像系统购自Bio-Rad公司；紫外-可见分光光度仪购自北京普析通用仪器有限责任公司。
在15 mL离心管中先加入5 mL聚蔗糖—泛影葡胺白细胞分层液(20 ℃，密度1.0770～1.080
0 g/mL)，然后缓慢加入5 mL血液，平衡10 min。平衡完毕后，400 r/min离心25 min。吸取上层和中层分界处的云雾状狭窄带，置于另一离心管中，加入2倍体积PBS混匀。400 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中加入2 mL PBS再次离心洗涤。洗涤完毕后，弃上清，沉淀即为外周血单核细胞，加入1 mL Trizol裂解细胞，转移至1.5 mL离心管，-80 ℃冰箱保存。
参考GenBank中登录的猪肌动蛋白(beta-actin，ACTB)、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、beta-2-微球蛋白(beta-2-microglobulin，B2M)、羟甲基胆素合成酶(hydroxymethylbilane synthase，HMBS)、核糖体蛋白L4(ribosomal protein L4，RPL4)、核糖体蛋白L11 (ribosomal protein L11，RPL11)、酪氨酸3-单氧化酶/氨酸5-单氧化酶激活蛋白zeta多肽(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta，YWHAZ)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1，HPRT1)、琥珀酸脱氢酶亚基A(succinate dehydrogenase complex subunit A，SDHA)、异柠檬酸脱氢酶3β(homo sapiens isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) beta，IDH3B)、β2-微管蛋白(tubulin beta 2B class Ⅱb，TUBB2B)和TATA盒结合蛋白1(TATA-box-binding protein 1，T
书籍是全世界的营养品BP1)基因序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计引物，引物序列信息见表1。
根据Trizol试剂说明书提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测总RNA的纯度和浓度，检测合格的样品进行反转录。反转录反应体系20 μL： dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL，随机引物(序列见表1) (100 μmol/L) 1 μL，总RNA 2 μg，加DEPC水补足至20 μL。根据SuperScript Ⅲ试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成，-20 ℃冰箱中保存备用。
以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增。PCR反应体系20 μL：cNDA 1 μL,2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，去离子水补足至20 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环。熔解曲线程序为：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；55 ℃ 2 min。每组试验重复3次。
将等量混合的12个样品的cDNA模板以10倍的比例稀释成6个梯度(107至102)，分别用不同浓度梯度模板进行实时荧光定量PCR反应，每组4个重复，以无引物组作为对照组，定量分析引物的扩增效率和特异性。LightCycler480Ⅱ软件分析并绘制标准曲线，计算出样本中各基因的平均Ct值，根据Ct值绘制定量标准曲线，扩增效率按E=10(-1/slope)计算。
将获得的Ct值数据按geNorm、Normfider和BestKeeper软件要求进行转化并带入进行分析。通过3种软件结果分析12个候选基因的表达稳定程度，确定最适合作为实时荧光定量PCR研究的内参基因。
Trizol法提取3头民猪4个不同温度条件下外血周单核细胞中的总RNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量发现，各样本均在28S、18S和5S的3个位置获得清晰条带，且无明显的降解，表明RNA完整性好，紫外分光光度计检测D260 nm/D280 nm比值均在1.8～2.0之间，RNA质量符合下步研究要求。
生物圈二号12对候选基因引物经PCR扩增后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物发现，条带单一无杂带(图1)。10倍比稀释不同基因模板进行实时荧光定量PCR，根据Ct值和稀释倍数构建标准曲线方程，回归系数(R2)均在0.98以上，扩增效率在90.9%～114.9%之间(表2),表明引物具有较高的扩增效率和良好的线性关系,满足实时荧光定量扩增条件。
以不同温度下民猪外周血单核细胞的cDNA为模板，实时荧光定量PCR 检测候选基因在不同模板中的转录水平。当Ct值越高，说明模板的起始含量越低，即基因的表达量越低；反之，Ct值越低，则反应了基因表达量越高。因此，以温度为横坐标，Ct值为纵坐标绘制折
线图见图2。由图2可知，12个内参基因的Ct值均在19～31之间，各基因的表达量顺序(即Ct值顺序)为：B2M(19.2550)>ACTB(20.7375)>RPL11(22.6975)>RPL4(23.3450)>YWHAZ(23.4825)>GAPDH(24.7625)>HPRT1(27.5400)>SDHA(27.6100)>HMBS(27.7475)>IDH3B(28.0500)>TUBB2B(28.5100)>TBP1(30.3225)。
geNorm分析中的M值表示基因的稳定性，M值越大表明基因的稳定性越低，M值越小则稳定性越高，M值<1.5可认为其表达相对稳定。本试验经过geNorm软件分析结果见图3。由图3可知，12个候选基因的M值均<1.5，稳定性由高到低(即M值由低到高)依次为：GAPDH/TBP1(0.13)>HPRT1(0.17)>SDHA(0.20)>YWHAZ(0.22)>B2M(0.25)>RPL11(0.29)>IDH3B(0.33)>TUBB2B(0.35)>ACTB(0.40)>HMBS(0.57)>RPL4(0.78)，表明在环境温度变化时，民猪外周血单核细胞中这12个候选基因都符合作为内参基因的标准，其中GAPDH和TBP1基因的表达最稳定。
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