宋旺;王小纪;郭瑞坚;张伟;张正青;李孟楼
江西医学院第二附属医院【摘 要】合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件.以存活时间为6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月的花绒寄甲成虫为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了核糖体蛋白11 (RPS),丁二酸脱氢酶复合物(SDHA)、组蛋白(Histone)、泛素结合蛋白(UBC)、cGMP依赖性蛋白激酶Ⅰ(PGK)、延伸因子(EF-1α)、β-肌动蛋白(β-Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白RPL13 (L13)、α-微管蛋白(α-Tubul in)共10个看家基因mRNA的表达情况.经过geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个统计学程序,综合分析确定RPS基因或α-Tubul in基因在不同存活时间的花绒寄甲中为较佳用于校正目标基因的内参选择,而RPS、GAPDH和α-Tubulin的组合为最佳校正目标基因内参基因组合. 【期刊名称】《西北农业学报》cip数据
【年(卷),期】2015(024)002
【总页数】6页(P156-161)
【关键词】实时定量PCR;内参基因;花绒寄甲
我们爱讲冷笑话【作 者】宋旺;王小纪;郭瑞坚;张伟;张正青;李孟楼
【作者单位】西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西安市林业技术推广中心,西安710061;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100
【正文语种】中 文
【中图分类】Q966
随着高通量测序技术的发展，多个物种转录组或基因组序列已揭晓，定量研究特定基因表达水平、揭示其功能的研究已日渐增多。荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)是一种在转录水平上对 mRNA 表达量进行定量检测的成熟技术，在基因表达的定量研究中广泛 应用[1]。该技术利用PCR反应体系中添加的特定荧光基团，实时监测整个 PCR 进程中产物的变化，即荧光信号的累积，从而对DNA、RNA 样品或者目标基因的表达进行定性、定量分析[2]。理想的内参基因应该是在所有细胞、不同发育阶段以及不同处理因素下其表达水平均不受影响[3]。看家基因(housekeeping gene)编码的蛋白是维持细胞结构和基本代谢所必需的，其表达水平在不同组织和器官中基本保持一致，一般选择的内参基因均为看家基因[4]。然而，盲目地使用一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能导致错误甚至相反的结论[5]。因此，在荧光定量 PCR 分析中，必须根据样品的不同，选择稳定性好的看家基因来做内参，以去除不稳定因素，获得可靠的试验结果。
在研究中一般使用geNorm、NormFinder和BestKeeper等标准化分析软件对给定看家基因的稳定性分析[6-8]。geNorm程序不但可以对选定的看家基因进行稳定性排序，而且能从给定的看家基因中筛选出 2个以上的最优内参组合，这样就能够更好地准确定量 PCR反应中基因mRNA的表达[9]。NormFinder程序与geNorm程序运行原理相似，运行该程序可生成基因表达稳定值，稳定值越低则表明基因表达越稳定[10]。Bestkeeper则是一款专门筛选内参基因的程序，它可以直接利用Ct 值通过反复配对相关分析和归一化分析，通过产生的
标准差(SD)和变异系数(CV)来评价各基因的稳定性[11]。
花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)成虫寿命达12 a以上[12]，这么久的存活期，使该昆虫成虫成为研究昆虫生长发育过程中相关基因表达的最好材料，但国内外并未见对其内参基因有筛选。在本研究中,以不同存活时间的花绒寄甲成虫为对象，检测花绒寄甲10个常用看家基因：核糖体蛋白11(RPS)、丁二酸脱氢酶复合物(SDHA)、组蛋白(Histone)、泛素结合蛋白(UBC)、cGMP依赖性蛋白激酶Ⅰ(PGK)、核糖体蛋白RPL13( L13)、延伸因子( EF-1α)、β-肌动蛋白(β-Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和α-微管蛋白(α-Tubulin)在正常条件下的转录表达水平, 并利用标准化分析软件进行内参基因稳定性分析, 筛选出花绒寄甲在不同存活时间中相对表达稳定的内参基因。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
钢骨混凝土供试花绒寄甲成虫，由西北农林科技大学林学院森林害虫生物防治实验室提供。成虫由人工饲料喂养，饲料主要成分为蚕蛹粉、琼脂、蛋黄等[13]。成虫在温控室内进行培养，温度为(23 ± 1) ℃，相对湿度(RH)为70%～80%。
1.2 总RNA的提取及cDNA第1链的合成
采用上海生工生物工程技术服务有限公司的UNIQ-10 Trizol RNA提取试剂盒。花绒寄甲的总RNA提取参照Petr等[14]的方法：取存活年限分别为6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月的花绒寄甲成虫各3头，分别将3头成虫加液氮直接研磨成粉状，然后迅速将粉末转到1.5 mL的离心管中，加入0.5 mL的Trizol裂解液震荡混匀。再按照试剂盒说明书进行RNA提取和净化。最后用30 μL的DEPC处理水溶解，保存于-80 ℃用于后续试验。每种样品取1 μg总RNA，参照Ferments的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit使用说明书合成cDNA第1链，用于PCR扩增或-20 ℃保存。
1.3 内参基因的选择和引物设计
β-Actin(NCBI登录号为KC683906)、GAPDH(NCBI登录号为 KC683907)和α-Tubulin(NCBI登录号为KC683908)基因序列为NCBI下载序列。RPS、SDHA、Histone、UBC、PGK、 L13和 EF-1α是由西北农林科技大学林学院森林害虫生物防治实验室花绒寄甲转录组Illumina Hiseq 2000TM测序数据获得，目前7个基因序列已上传至NCBI并获得命名。利用Primer Premier 5.0软件设计引物，退火温度为58 ℃～60 ℃，由上海生工生物工程技术服
务有限公司合成。引物信息如表1所示。
1.4 荧光定量
采用康为世纪公司的荧光定量试剂盒和Bio-Rad公司IQ-5实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR试验。PCR反应体系如下：2×Ultra SYBR Mixture 12.5 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，cDNA模板1 μL，无菌水9.5 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min，接着进行50个循环，循环条件为95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s；在延伸阶段检测荧光强度，收集信号。之后从60 ℃至95 ℃，每隔0.5 ℃停留0.05 s做熔解曲线，检测荧光强度变化，以确定PCR扩增的特异性。
表1 实时荧光定量PCR的检测基因及其引物Table 1 The internal reference genes and primer pairs for real-time fluorescent quantitative PCR基因名称Gene name引物序列(5'→3')Primer sequences (5'→ 3')基因序列号Accession number扩增子/bpProduct sizeRPSF: AAAATGTGGGCTACACCAAAGAR: GAAAAGCACTCGCAAAAATGGCKJ489363159SDHAF: CTGTTGCTGCTCAGGGTGGTATR: AGACTGTGGAGCTTCCTTCGTCKJ489362148Hist
科尔曼oneF: GCAACCTTCTCCGCGTCCACTTR: ACCGTCTCATCCGCCAACATCCKJ489366204UBCF: CGGGAAACGCTGAAATACCTTR: ATTCGGATAATCACGCAGTCAKJ48936899PGKF: TTATGGGTGTTGGACCGAAATR: TTATCGCCCACATCACCTTCTKJ489364101 L13F: GTGAGAAATGGGCACGACAAGGR: ATTCCTGCATCAGCACCGACTAKJ489365118 EF-1αF: TCCTTCAAATATGCCTGGGTACTR:AAATCTCTGTGTGTCCAGGGGCATKJ489367137β-ActinF: TACCGCCACAGCCTCAACTR: CAGGATTCCATTCCCAAGAKC683906168GAPDHF: TAACTTTGGCATCGTTGAGGR: AGCGGCGGGAATGATGTTTTKC683907132α-TubulinF: TCGGTGGTGGTACTGGGTCTR: ACGGCTGTTGAAACTTGAGGAKC683908154
运动控制
1.5 数据处理与分析
引物扩增效率(E)计算公式[15]为E=10-1/斜率。标准曲线制作时，将第1链cDNA模板依次稀释6个梯度，每个梯度稀释5倍，每个反应3次生物性重复，通过实时定量PCR分析。标准曲线相关系数、斜率等系列参数通过Excel 2003计算所得。
根据10个内参基因在不同存活年限花绒寄甲中的相对表达量，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对各个内参基因的表达稳定性进行统计学分析，从而筛选出最优的内参基因。
2 结果与分析
2.1 总RNA质量检测
花绒寄甲各样品总RNA的琼脂糖凝胶电泳显示，所有 RNA 样品均有完整带型的18S rRNA和 28S rRNA ( 图1)，核酸检测仪检测各样品的OD260/OD280为1.90～2.10，电泳和核酸检测分析结果表明 RNA 样品质量良好，未发生降解，能满足后续试验操作的要求。
2.2 引物扩增效率及特异性
为了验证10个看家基因的引物特异性，进行RT-PCR检测，反应程序为：95 ℃预变性3 min；接着进行30个循环，循环条件为95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 min，72 ℃ 30 s；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示每种引物均扩增出预期大小的片段，没有出现引物二聚体，说明引物的特异性较好(图2)。然后通过梯度稀释cD
NA样本作为模板进行PCR扩增后绘制每个内参基因的标准曲线，得到引物的相关参数(表2)。从表中可以看到10个内参基因的线性相关系数(R2)变化范围为0.980～0.996，扩增效率为94%～110%，且10个内参基因的熔解曲线都只出现单一的信号峰，符合实时荧光定量PCR对扩增效率的要求。
2.3 内参基因的表达稳定性分析
2.3.1 用geNorm程序计算内参基因的稳定性 geNorm程序根据计算平均表达稳定值(M)对选择的内参基因稳定性进行排序，出合适的内参基因。由于M值越小，基因表达稳定度就越高；M值越大，基因表达稳定度就越低。所选10个看家基因表达稳定度由高到低依次为RPS>GAPDH>α-Tubulin>Histone>EF-1α> L13>UBC >PGK >β-Actin>SDHA(图3)。
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