RealTimePCR结果分析与实验设计
做Real Time PCR的大体有四个目的。
2. 检测siRNA靶基因的下调量。
3. 观测某个基因在一系列细胞中的表达模式。
4. 别出心裁的实验设计。
四种实验对应的数据处理方法是不同的。但原理是一样的,即都基于这个公式:
Ct = -k * log2(X0) + b (1)
其中k=1/log2(1+E),其中E代表PCR的扩增效率,如每个循环扩增的原DNA的90%,则E=0.9。
音箱
b是个无关紧要的常量,除非是绝对定量rt PCR,否则是用不到b的。
所谓的2 delta方法是这样的:
如有基因A,内参基因C,样品甲和乙。欲知基因A在甲中的表达量相对于乙是上调还是下调,上调或下调了多少。
应得到四个Ct值:Ct(甲A),Ct(甲C),Ct(乙A)和Ct(乙C)。
ΔCt(甲)=Ct(甲C)-Ct(甲A)=k*log2[X(甲A)/X(甲C)]
ΔCt(乙)=Ct(乙C)-Ct(乙A)=k*log2[X(乙A)/X(乙C)]
ΔΔCt=ΔCt(甲)-ΔCt(乙)=k*log2贾成炳[A在甲中的表达量/A在乙中的表达量]
福泽谕吉如此则:
R=A在甲中的表达量/A在乙中的表达量=2^(ΔΔCt/k)北京谐波传动技术研究所
这样一来,只要知道k值就可以了。k=1/log2(1+E),如果扩增效率是100%,则E=1,k=1。否则只要做个浓度梯度,就可把它计算出来。
1. 做siRNA时,R<1,(1-R)*100%即siRNA下调靶基因的量。
2. 表达模式分析只要一个delta就行了。慧美杂志
3. 一通百通,无论怎么弄,都有解决办法。
实验设计时,每板重复三次,做三个板,是为了消除PCR本身和样品本身的误差,是必不可少的。
如同微阵列一样,三次是最少次数。取平均值可以,中数也可以。无论如何,实验设计一定要严谨。