关于内参基因的选择

实验内参，即是在检测细胞内分⼦表达变化时选择的参照物，其在细胞内的表达相对恒定，在处理因素作⽤条件下不会发⽣表达改变的基因。内参同样可以校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

1、管家基因

牛顿第二定律教案最普通的内参是内源性参照基因，也就是管家基因（持家基因，house keeping gene）。

管家基因是⼀类始终保持着低⽔平的甲基化并且⼀直处于活性转录状态的基因，⾼度保守并且在⼤多数情况下持续表达。其表达⽔平受环境因素影响较⼩，⽽且是在个体各个⽣长阶段的⼤多数，或⼏乎全部组织中持续表达，或变化很⼩，因此常存在于⽣物细胞核的常染⾊质中。它的表达只受启动序列或启动⼦与RNA聚合酶相互作⽤的影响，⽽不受其他机制调节。

管家基因维持细胞最低限度功能所不可少的基因, 如编码组蛋⽩基因、编码核糖体蛋⽩基因、线粒体蛋⽩基因、糖酵解酶的基因等。这类基因在所有类型的细胞中都进⾏表达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。

部分⼈类管家基因列表

2、内参基因选择的条件

1、不存在假基因，以免基因组DNA的扩增；

2、⾼度或中度表达，避免太⾼或太低的丰度；

3、稳定表达于不同类型的细胞和组织中，表达量⽆明显差异；

4、表达⽔平与细胞周期、活化等⽆关；

5、不受外源性或内源性因素的影响。

3、不同管家基因

在选择管家基因作为内参时，⾸先要按不同类型的分⼦选择正确的内参。曾看到有⼈⽤检测miRNA时选择了GAPDH作为内参呢。

a、检测mRNA时的内参

通常使⽤的是GAPDH、beta-actin、tubulin

调值公式法GAPHD颈部肿块的鉴别诊断

GAPDH

GAPDH是糖酵解反应中的⼀个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分⼦量146kDa。该酶基因为管家（house keeping）基因，⼏乎在所有组织中都⾼⽔平表达，在同种细胞或者组织中的蛋⽩质表达量⼀般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响⽽保持恒定，故被⼴泛⽤作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。

beta-actin

β-Actin是PCR常⽤的内参，β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。β-Actin是横纹肌肌纤维中的⼀种主要蛋⽩质成分，也是肌⾁细丝及细胞⾻架微丝的主要成分，具有收缩功能，分布⼴泛。

ACTB

另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有⼀定的区别。⽐如⼀些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少，不适合做内参。

tubulin

tubulin（微管蛋⽩）是球形分⼦，有两种类型：α微管蛋⽩(α-tubulin)和β微管蛋⽩(β-tubulin)，这两种微管蛋⽩具有相似的三维结构，能够紧密地结合成⼆聚体，作为微管组装的亚基。α亚基由450个氨基酸组成，β亚基是由455个氨基酸组成，它们的分⼦量约55 kDa。

tubulin

由于β-Tubulin的检测分⼦量⼤约在55kD，因此该内参抗体不是很适合⽤于检测50kD-60kD⼤⼩⽬标蛋⽩的WB实验中。

b、检测蛋⽩时的内参

检测蛋⽩时，常⽤蛋⽩内参有GAPDH、β-Actin、β-tubulin。选择的内参要跟⽬标蛋⽩分⼦量差5KD以上，所以需要根据⽬标蛋⽩的分⼦量来进⾏内参的选择。

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c、检测miRNA时的内参

small nuclear RNA (snRNA)和small nucleolar RNA (snoRNA)长度与miRNA相近，200bp左右，在多种组织细胞中⾼表达，不涉及miRNA的调节途径，且与miRNA探针设计⽅法相同，所以snoRNA是很好的内参选择。

常⽤内参

简单介绍⼀下常⽤的内参U6：U6是⼀类snRNA，它是由RNA聚合酶III转录。主要形成⼩核核糖核蛋⽩颗粒，定位与细胞核内，表达稳定。

d、检测lncRNA时的内参

检测lncRNA时，内参选择和mRNA⼀样，可以选择GAPDH、beta-actin等。GAPDH虽然在很多细胞实验中都很稳定，但是因为它是个糖代谢相关酶，在很多糖代谢变化的实验中都会剧烈变化,⽐如缺氧、缺⾎、糖尿病以及某些肿瘤细胞中。因此内参不是绝对的。同样，beta-actin也不是绝对的，如果涉及到细胞⾻架重排，解聚，重组的实验，beta-actin⼀样不可靠。如果不确定，可以多选⼏个内参候选，⼀个变化量⼩的。最后，18S rRNA也可以作为lncRNA检测时的内参。

当然，还有其他的内参可以作为lncRNA检测的内参，如：RPL13A

e、检测circRNA时的内参阻尼系数

检测circRNA时可以⽤18S rRNA作为内参。

18S rRNA是⼀类核糖体RNA，所常⽤来进⾏⽣物分类的依据。由于18SrRNA在⽣物中的表达⽐较保守，所以⽬前也⽤来作为内参。

⽤18s RNA作为RT-PCR的内参，应该和β-actin是⼀个道理，半定量的⽬的是要看总RNA中的⽬的基因mRNA的表达量，内参的⽬的是去除⼀些系统误差。

有⽂献做过⽐较，之所以18s RNA⽐β-actin好是因为它含量丰富，且任何情况下稳定存在，所以受外界调控影响⼩，半定量时背景更加稳定。

但是不同的是18s是rRNA，没有A尾巴，所以选它作内参时，理论上总RNA转录时不能⽤OligodT作反转录引物，⽤随机引物或6聚体引物,OligodT转录出来的可都是mRNA啊！如果选β-actin就不存在这个问题，因为它mRNA，有A尾巴。

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