热带作物学报2021, 42(5): 1282 1289
Chinese Journal of Tropical Crops
卢亚莉，张世鑫，杨署光，田维敏，史敏晶*
中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室，海南海口 571101
摘要：在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中，为获得可靠的基因表达结果，筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97’健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料，收集其中的胶乳，采用qRT-PCR技术，结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件，综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定；UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b 在三级死皮树中较稳定；UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证，筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b，其中ejf2是最佳内参基因，18S不适合作为本研究的内参基因。
关键词：橡胶树；死皮相关；内参基因；qRT-PCR
中图分类号：S794.1 文献标识码：A
Selection of reference genes for qRT-PCR in TPD-related Study of ‘Reyan 7-33-97’ in Rubber Tree (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
第四类情感
LU Yali, ZHANG Shixin, YANG Shuguang, TIAN Weimin, SHI Minjing*
Rubber Research Institute, CATAS / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops, Haikou, Hainan, 571101, China
Abstract: In order to obtain reliable gene expression results for TPD-related study of rubber tree, the selection of suit-able reference genes is very important. In the present study, using the latex from the healthy rubber tree, the third grade tapping panel dryness (TPD) tree and the TPD-recovering tree of ‘Reyan7-33-97’ as the experimental materials, the expression stability of 20 candidate reference genes were evaluated by using quantitative real-time PCR (qTR-PCR) and softwares of geNorm, NormFinder and BestKeeper. The results showed that, reference genes eif2、ACT7a and UBC2b w
ere the top three stable genes in the healthy tree; UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b and ACT7b were all stable genes in the third grade TPD tree; UBC2b、eif2 and ROC3 were stable genes for the TPD-recovering rubber tree. Based on the different stable reference genes, relative expressions of HbDXS1, HbHMGS2 and HbNIN3 genes were analyzed respectively. The results showed that eif2 and UBC2b were a couple of stable reference genes for TPD-related study; the eif2 was the most stable internal reference gene; 18S gene was not suitable as reference gene for qTR-PCR in this study.
Keywords: Hevea brasiliensis Muell. Arg.; TPD-related; reference genes; qTR-PCR
DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.012
收稿日期 2020-05-19；修回日期 2020-07-30
基金项目 国家重点研发计划项目（No. 2018YFD1000502）；国家自然科学基金项目（No. 31870590）；现代农业产业技术体系建设专项（No. CARS-33-YZ1）。
作者简介 卢亚莉（1991—），女，硕士，研究方向：作物遗传育种。*通信作者（Corresponding author）：史敏晶（SHI Minjing），E-mail:********************。
第5期卢亚莉等: 橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选 1283
橡胶树死皮病，即割面干涸病（tapping panel dryness，TPD），是在橡胶树的割线上出现局部或全部不排胶的症状，在世界各国的植胶园中普遍发生，严重影响天然橡胶产量，缩短橡胶树的经济寿命，给橡胶产业带来严重危害。我国橡胶树死皮病发生情况尤其严重，成为当前天然橡胶产业的主要限制因子之一[1]，因此，探索死皮病的发生机理并寻求解决办法已成为当务之急。利用分子生物学手段，研究橡胶树死皮病发生和康复的分子机理已成为近年来的研究热点，其中，对差异表达基因的筛选则是进行基因功能研究和进行分子调控的基础。
基因表达分析的手段众多，单个RNA的稳态水平可以用不依赖PCR的方法如Northern blotting[2]和原位杂交[3]等来衡量，但这些技术耗时长，RNA用量大，实验难度较大，并且重现性较差。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的技术由于具有特异性强、灵敏度高、精确度高、重现性好、通量较高、动态范围较宽、无需后PCR 处理[4-7]等优点而成为目前最受欢迎的mRNAs 检测方法。但qRT-PCR的准确性受到样品间起始RNA的质量和数量、cDNA合成效率以及PCR 扩增效率等诸多因素的影响[8]，控制和减少误差的一个较好的方法就是选择合适的内参基因。理想的内参基因的表达水平应该在不同的生理与环境条件下稳定不变[9]，但已有研究表明，生物体内并没有真正的、完全稳定的内参基因。目前，在植物qRT-PCR分析中普遍使用的内参基因有Actin、18S等，但已有研究发现一种植物中的某个较为理想的内参基因并不一定适合在其他植物中使用。因此，为获得准确的基因表达数据，每进行一项研
究实验，筛选出试验条件下特异性的内参基因对获得准确的基因表达结果至关重要[6, 10]。一般用于植物和动物内参基因分析的常用软件是GeNorm、NormFinder和BestKeeper[11-12]，借用这些软件，筛选研究所需的合适的内参基因是可以实现的。
大量研究表明，常用的内参基因18S rRNA、HbActin在橡胶树中不具有普适性，不同的实验系统最好需要单独筛选内参基因。目前，关于橡胶树内参基因的报道主要是针对乳管分化、胶乳再生、排胶、不同组织、不同激素处理等展开，橡胶树死皮发生，尤其是死皮康复研究中，缺乏相应的内参基因的筛选。为准确研究死皮以及康复这一过程中相关基因的表达，对该过程中的内参基因进行分析，筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究选取18S rRNA（简称18S）、ACT7a、ACT7b、ADF、ADF4、CYP2、eifAa、eifAb、eif2、eif3、UBC2a、UBC2b、UBC1、UBC3、UBC4、ROC3、PTP、RH2a、RH2b、FP共20个基因作为健康橡胶树、死皮树和施用死皮康复营养剂后的死皮恢复植株相关研究中的候选内参基因，通过qRT-PCR技术，并借助GeNorm、NormFinder 和BestKeeper软件对20个内参基因在‘热研7-33-97’不同样品中的表达稳定性进行评价，以期筛选出合适的内参基因，为橡胶树死皮以及康复相关研究中的基因表达分析奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）无性系‘热研7-33-97’定植于中国热带农业科学院海南儋州两院试验场。选取长势大致相同的‘热研7-33-97’的健康割胶树、三级死皮树和施用死皮康复营养剂后的死皮恢复树作为试验对象，每种类型橡胶树至少3株重复。采用3 d一刀，1/2 S 的割胶制度，按照以下方法分别采集不同的胶乳样品：（1）健康树距离地面1 m处连续割胶5刀，收集每一刀的胶乳，分别编号为0（CK）、1、2、3、4刀；（2）三级死皮树在正常割胶的情况下，针刺收集不排胶部位、点状排胶部位、连续排胶部位水囊皮中的胶乳；移液器收集点状排胶部位和连续排胶部位割线上的胶乳；（3）死皮后经施用康复营养剂恢复的橡胶树，距离地面1 m处连续割胶5刀，收集每一刀的胶乳，分别编号为0（CK）、1、2、3、4刀。收集的胶乳直接加入到裂解液SL中，混匀后，冰上保存，带回实验室后立即提取总RNA，于–80 ℃贮存备用。
1.2方法
1.2.1 胶乳总RNA提取与cDNA合成橡胶树的胶乳总RNA的提取根据RNAprep Pure Plant Kit多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）操作说明进行。通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取的总RNA 的完整度和纯度。按照RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA）试剂盒说明进行cDNA的反转录合成，合成产物于–20 ℃冰箱保存备用。
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1.2.2 内参基因的表达分析根据已报道的橡胶树内参基因，选择CYP2、18S、ROC3、FP、PTP、ACT7a、ACT7b、ADF、ADF4、RH2a、RH2b、eifAa、eifAb、eif2、eif3、UBC1、UBC2a、UBC2b、UBC3和UBC4共20个基因作为候选的内参基因，采用Real-time PCR方法，分析这些基因在不同健康状况下橡胶树的不同部位和不同刀次收集胶乳中的表达情况。所选内参基因的PCR引物来源于本研究团队。
1.2.3 基因qRT-PCR分析以cDNA为模板，分别对候选内参基因进行实时荧光定量PCR分析，反应平台为CFX384 Real-Time PCR Detection (Bio-rad, USA)。反应体系为10 L体系，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。反应使用的试剂为2x Transstart Tip Green qPCR Super Mix。每个PCR反应进行3次技术重复。利用Bio-rad CFX manager 3.0软件，采用2–ΔΔC T算法分析基因的相对表达量。
1.3数据处理
采用Gern Norm和Norm Finder软件对内参基因稳定性进行分析；Original 8.0软件绘制内参基因稳定性图；SPSS 19.0以及Excel 2007进行统计学分析；AI软件进行图形组合。以筛选出来的内参基因为参照，对所选的目的基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3的表达水平进行定量分析，验证内参基因的有效性。
2结果与分析
2.1巴西橡胶树胶乳总RNA质量检测
在qRT-PCR基因表达分析中，总RNA的质量直接影响后续实验结果。提取的胶乳总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测显示，28S rRNA和18S rRNA条带清晰完整（图1），无降解现象，亮度比值约为2∶1。NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific Inc., USA）测定OD260/OD280比值在1.8~2.1之间，出现单个峰值，表明RNA完整性好，纯度较高，可用于后续研究。
2.2内参基因Ct值分析
基因的Ct值大小与其表达量成反相关，Ct 值越小，表达量越高，反之亦然[13]。对20个候选内参基因在不同胶乳样品中得到的Ct值进行分析发现，这些基因的Ct值在8~32之间，范围较广，表明不同基因表达的丰度存在较大的差异。其中18S的Ct值最小，表明其基因的表达量最高；CYP2的Ct值最高，表明其表达量最低；其余基因的Ct值介于15~25之间，分布较集中，表达丰度居中（图2）。
图1胶乳样品总RNA电泳图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of latex
图2内参基因的Ct值
永磁接触器
Fig. 2 Ct values of candidate internal reference genes
2.3候选内参基因在不同样品中表达稳定性分析与评价
2.3.1 GeNorm分析利用GeNorm软件对候选内参基因的相对表达量进行统计分析，通过计算基因的表达稳定值（M）评价基因的表达稳定性，基因的M值越小，表达越稳定[14]。根据内参基因的稳定性从低到高进行排序作折线图，除混合的胶乳样品外，其他样品中大部分基因的M值低于0.5，有较好的稳定性（图3）。
在健康树胶乳样品中，稳定性由高到低排名前10的基因分别是eif2、RH2b、UBC2a、UBC3、eifAb、PTP、ADF4、eifAa、FP和UBC2b，并且其M值差异不大，均低于0.5。其中eif2、RH2b 和UBC2a最稳定，M值约为0.4。最不稳定的3个内参基因为18S、CYP2、ROC3，M值高于0.75（图3A）。
在三级死皮树不同胶乳样品中，稳定性由高到低排名前10的基因分别是UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、UBC1、ACT7b，且M值差异不明显，均低于0.4，都可以作为合适的内参基因。其中，UBC3、eifAb和eifAa最稳
第5期 卢亚莉等: 橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR 内参基因筛选 1285
图3 橡胶树不同胶乳样品中候选内参基因表达稳定值（M ）和配对组合（V ）
Fig. 3 Expression stability (M ) and pairwise combination (V) of the candidate reference genes in
different latex samples of rubber trees
operators定，M 值约为0.2。最不稳定的内参基因为18S ，M 值高于1.0；其次为CYP2、eif3，但M 值也在0.5以内（图3B ）。
在死皮康复树胶乳样品中，稳定性由高到低排名前10位的基因分别是UBC2b 、eif2、ROC3、ADF4、PTP 、UBC4、RH2b 、UBC1、ACT7b 、eifAb ，且M 值均低于0.5。其中，UBC2b 、eif2和 ROC3最稳定，M 值约为0.4。最不稳定的3个内参基因为RH2a 、CYP2、eifAa ，M 值均高于0.6（图3C ）。
在所有胶乳混合的样品中，有4个基因的M 值大于1.5，其他基因的M 值也在1.0偏上，总体来看，表达稳定性略差。稳定性排名前10的基因
分别是eif2、
UBC3、UBC4、UBC2a 、eifAb 、ACT7a 、UBC2b 、ACT7b 、UBC1、ADF 。其中，eif2、UBC3和UBC4最稳定，M 值约为0.9。最不稳定的3个内参基因为CYP2、FP 和 PTP ，M 值高达2.5以上（图3D ）。之所以在这个组合中M 值比较大，可能与胶乳样品是来自状态完全不同、差异明显的胶乳样品混合有关。
综上所述，根据M 值的高低，在全部样品中均有良好稳定性的5个内参基因有eif2、UBC2b 、RH2b 、UBC3、UBC4，稳定性一直都较差的有18S 和CYP2两个基因。
GeNorm 软件还可以通过成对的变异值（V n /V n+1）来确定标准化所需的参考基因的最佳数量[8]，阈值上限是0.15，以确定所需内参的最佳数目。在此研究中，成对的变异值在0.15左右（图3E ），利用GeNorm 软件对配对组合（V n /V n+1）分析发现，在橡胶树的不同胶乳样品中选出2个内参基因就可以进行标准化，这与之前一些物种的研究相似[15-16]。
三星掌上电脑
2.3.2 NormFinder 分析 采用NormFinder 软件分析稳定值（SV ），其数值大小与稳定值呈负相关[17]，即数值越小稳定性越高，进一步验证geNorm 分析的结果。
结果表明，在健康树胶乳样品中，稳定性由高到低排名前10的基因分别是eif2、ACT7a 、UBC2a 、ADF4、RH2b 、UBC3、UBC4、PTP 、eifAb 、UBC2b （图4A ），其中有8个基因与geNorm 评价的前10位基因相同；在三级死皮树胶乳样品中，排名前10位的基因分别是eifAb 、eifAa 、UBC2b 、UBC3、RH2b 、UBC4、ADF4、FP 、ACT7a 、eif2（图4B ），其中也有9个基因与geNorm 评价的前10位基因相同；在死皮康复胶乳样品中，排名前10位的基因分别是UBC2b 、eif2、ROC3、ADF4、UBC4、PTP 、RH2b 、UBC1、ACT7b 、eifAb ，
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图4 橡胶树不同胶乳样品中候选内参基因的表达稳定性
Fig. 4 Expression stability of the candidate reference genes in different latex samples of rubber tree济源研修茶座
与geNorm 评价的前10位基因排序一致（图4C ）；在所有胶乳的混合样品中，排名前10位的基因分
别是UBC4、
eif2、UBC2a 、UBC3、UBC2b 、ACT7b 、ACT7a 、eifAb 、UBC1、ADF ，与geNorm 评价的前10位基因相同（图4D ）。综合来看，NormFinder 和geNorm 分析的实验结果中，得出eif2、UBC2b 、UBC3、UBC4、RH2b 稳定性好，而18S 和CYP2表达稳定性较差的结果是一致的。
定滑轮和动滑轮
2.3.3 BestKeeper 分析 BestKeeper 软件可用于对候选内参基因在各样品中的平均Ct 值进行分析[18]。一般稳定的内参基因在BestKeeper 中具有较高的决定系数（coefficient of determination,
R 2）
。由结果可知（表1），健康橡胶树胶乳的稳定性排名前10的基因依次是ACT7a 、UBC2b 、PTP 、UBC3、eif2、FP 、RH2b 、RH2a 、UBC2a 、eifAb ；三级死皮树胶乳则是RH2b 、UBC2b 、FP 、UBC1、eifAa 、ACT7a 、eif2、UBC3、ACT7b 、eifAb ；死皮康复橡胶树胶乳则是FP 、ROC3、UB
C2b 、eifAb 、ADF 、18S 、eif2、RH2a 、ACT7a 、RH2b ；在混合胶乳中则是：eif2、eifAa 、ADF 、ADF4、UBC3、eifAb 、UBC2a 、ACT7a 、eif3、UBC4。 GeNorm 、NormFinder 和BestKeeper 三个软件的评估结果既有一致性，也有差异性。GeNormh 和
表1 候选内参基因稳定性
Tab. 1 Stability analysis of candidate reference genes
健康树 Healthy tree 死皮树 TPD tree 康复树 Recovery tree 混合Mix 基因Gene R R 2R
R 2
R
R 2
R
R 2
18S
0.279
0.0780.1840.034 0.765 0.585 0.7320.536ACT7a 0.9970.9940.8930.797 0.642 0.412 0.8360.699ACT7b 0.8230.6770.8680.753 0.555 0.308 0.5970.356ADF 0.8740.7640.7350.54 0.78 0.608 0.91
0.828
ADF40.95 0.9030.8470.717 0.6 0.36 0.9090.826
CYP20.4680.2190.08 0.006 –0.155 0.024 –0.6670.445eif2 0.9610.9240.8760.767 0.741 0.549 0.9560.914eif3 0.6770.4580.6 0.365 0.517 0.267 0.8 0.64 eifAa 0.9490.9010.8940.799 0.208 0.043 0.9190.845eifAb 0.9510.9040.8650.748 0.783 0.613 0.8640.746FP 0.9610.9240.9220.85 0.958 0.918 –0.1450.021PTP 0.9660.9330.75 0.563 0.494 0.244 –0.3970.158ROC30.7540.5690.6940.482 0.865 0.748 0.67
0.449
RH2a 0.9560.9140.7950.632 0.667 0.445 0.6440.415RH2b 0.9570.9160.9980.996 0.626 0.392 0.5270.278UBC10.7280.53
0.92 0.846 0.488 0.238 0.5240.275
UBC30.9620.9250.87 0.757 0.292 0.085 0.8730.762UBC4
0.932
0.8690.8310.691 0.398 0.158 0.7470.558UBC2a 0.955
0.9120.7210.52 0.542 0.294 0.8570.734
UBC2b 0.97 0.9410.9820.964 0.864 0.746 0.6980.487
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