万方数据
万方数据
ｉ玉棘．等ｉ内参基因Ｂ．ａｃｔｉｎ质粒标推品的构建 Ｒ＇］＇矽Ｒｗｗｗ．ｃＲｒｅＲ．ｏｒｇ
标准品１．０ｕＬ、ｄｄＨ２０８．０ｕＬ。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲｅａｌＴｉｍｅ
ＰＣＲ扩增仪扩增，反应条件为９５℃预变性５Ｓ，９５℃变
性５Ｓ，６０℃退火／延伸２０Ｓ，共４０个循环。
主要观察指标：①ＲＮＡ质量检测结果。②扩增的目
的片段电泳结果。③Ｂ．ａｃｔｉｎ基因测序结果。④标准品的
扩增情况。
设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，干预
实施为第一、三、四作者，结果评估为第五作者，均经
巴林银行过系统培训，未使用盲法评估。．
２结果
２．１ＲＮＡ质量检测结果核酸分析仪检测抽提成人外
周血总ＲＮＡ，Ａｖｏｏ／Ａ２舳比值为１．８－２．０，提示总ＲＮＡ质量
较好。取５ｕＬＲＮＡ经１．５％琼脂糖凝胶电泳，清晰显示
３条带，提示总ＲＮＡ完整性较好，见图１。
２．２扩增的目的片段电泳结果扩增的ＰＣＲ产物５０ｕＬ
上样１．５％琼脂糖平板电泳，出现１８６ｂｐ的目的片段，见
图２。
１ＳＳＮ１６７３，８２２５ＣＮ２１—１５３９１ＲＣＯＤＥＮ：ＺＬＫＨＡＨ
２．３Ｂ．ａｃｔｉｎ基因测序结果Ｂ．ａｃｔｉｎ质粒测序结果与原
spss16.0Ｂ．ａｃｔｉｎｇ］物序列用ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５软件比对，一致率为
１００％，见图３。
２．４标准品的扩增将Ｃｔ值与不同浓度标准品的对数
值拟合作图，得出的标准曲线显示，Ｃｔ值和模板起始浓
度对数值之间具有较好的线性关系（舻＝１），见图４。
３讨论
在实时荧光定量聚合酶链反应中，模板定量有两种
９５０３万方数据
万方数据
内参基因β-actin质粒标准品的构建
作者：王玉林， 史进方， 蔡惠芬， 樊一笋， 顾国浩， Wang Yu-lin， Shi Jin-fang， Cai Hui-fen， Fan Yi-sun， Gu Guo-hao
作者单位：苏州大学附属第一医院检验科，江苏省临床免疫学实验室，江苏省苏州市,215006
刊名：
中国组织工程研究与临床康复
英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
年，卷(期)：2008，12(48)
被引用次数：0次
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3.陈凤花.王琳.胡丽华实时荧光定量RT-PCR内参基因的选择[期刊论文]-临床检验杂志 2005(05)
4.Révillion F.Pawlowski V.Hornez L Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene expression in human breast cancer 2000(08)
5.Vila MR.Nicolas A.Morote J Increased glyceroldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression in renal cell carcinoma identified by RNA-based,arbitrarily primed polymerase chain reaction 2000(01)
6.Mori R.Wang Q.Danenberg KD Both beta-aetin and GAPDH are useful reference genes for normalization of quantitative RT-PCR in human FFPE tissue samples of prostate cancer 2008(14)
7.ZhuG.ChangY.Zuo J Fudenine,aC-terminai truncated rat homologue of mouse prominin,is blood glucose-regulated and can up-regulate the expression of GAPDH 2001(04)
世博文化中心8.Tricarico C.Pinzani P.Bianchi S Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reacti
on:normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies 2002(02)
9.Lossos IS.Czerwinski DK.Wechser MA Optimization of quantitative real-time RT-PCR parameters for the study of lymphoid malignancies 2003(04)
10.Ghosh T.Soni K.Scaria V MicroRNA-mediated up-regulation of an alternatively polyadenylated
variant of the mouse cytoplasmic {beta}-actin gene 2008
11.Holford NC.Sandhu HS.Thakkar H Stability of beta-actin mRNA in plasma 2008
1.期刊论文陈可.王增产pcDNA3.1载体对内参基因表达影响分析-重庆医科大学学报2010,35(6) 目的：研究转染质粒pcDNA3.1对内参基因表达影响差别，为今后在采用pcDNA3.1载体进行表达分析时内参基因的选择提供参考.方法：选用HepG2、HEK293、Hela、A549、QGY共5种细胞转染pcDNA3.1空载体质粒，转染后48 h提取细胞总RNA荧光定量PCR法比较内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphste dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)、18sRNA表达水平差异，提取细胞总蛋白，检测GAPDH、β-actin表达水平差异.结果:5种细胞在转染质粒pcDNA3.1后，内参基因转录和蛋白表达均出现不同程度的下降，其中以β-actin下降最为明显,GAPDH及18sRNA在转 录水平下降幅度小，且下降程度接近.结论:pcDNA3.1质粒转染造成基因表达非特异性抑制，其中对管家基因β-actin影响较大，因此在应用pcDNA3.1来源载体进行基因功能分析时，不推荐使用β-actin作为内参基因.
2.期刊论文周瑞雪.蒙涛.孟海波.陈敦学.宾石玉.成嘉.符贵红.褚武英.张建社.ZHOU Rui-Xue.MENG Yao.MENG
Hai-Bo.CHENG Dun-Xue.BIN Shi-Yu.CHENG Jia.FU Gui-Hong.CHU Wu-Ying.ZHANG Jian-She鳜鱼基因表达转录分
析中的内参选择比较-动物学研究2010,31(2)
目前基因表达的转录分析多采用单一或多个看家基因作为内参柬校正目的基冈的表达量.该实验以鳜鱼6个不同组织和5个不同胚胎发育阶段为研究对象，应用实时荧光定量PCR技术，观察了GAPDH、β-actin和18SrRNA三个看家基因mRNA水平的表达情况.geNorm统计分析表明，胚胎发育阶段β-actin表达最为稳定；不同的组织样品间,GAPDH表达最为稳定：而18SrRNA的表达在不同的发育阶段不稳定.当利用多基因作为内参时，使用两个最稳定表达的看家基因即可对目的基因的表达进行准确校正.该结果证实了基因表达转录分析中内参基因选择的必要性，同时为鳜鱼等鱼类基凶表达分析时内参基因的选择提供有价值的参考.
3.学位论文孙俊红大鼠肌肉挫伤后组织中时间相关基因表达的研究2009
目的: 运用差异显示技术结合硝酸银染筛选大鼠肌肉挫伤后与正常肌肉表达差异的基因，并通过Real—timePCR方法研究差异基因与损伤时间的关系，旨在寻一种或几种与损伤相关的敏感基因，为法医学损伤时间推断提供科学、有效的指标。 钛材料方法:
1. 12只健康成年SD大鼠随机分为实验组和正常对照组。实验组大鼠建立肌肉挫伤模型，损伤后4小时处死，提取100mg损伤处肌肉组织。对照组大鼠在规定时间内处死，提取相同部位100mg肌肉组织。两组肌肉组织经SV Total RNA Isolation system提取总RNA，并经Agilent 2100 Bioanalyzer进行质量控制检测，SIN值大于8.0的样本经反转录后用于下游实验。
2．采用4种锚定引物和3种随机引物共12种组合对实验组和对照组样本进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后硝酸银染进行差异表达分析。采用煮沸法回收差异条带，并进行二次扩增，扩增产物纯化后与载体连接、克隆，进行序列分析，将测序所得差异序列与GenBank进行同源性比较。
3.4只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组和损伤组，提取各组样本的总RNA。在差异序列两端设计
特异性引物，采用SYBR()GreenⅠ染料法进行Real—timePCR扩增，通过分析扩增曲线及溶解曲线，鉴定差异表达基因的真伪。
4.12只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组、损伤后6小时组和损伤后12小时组。采用Real—timePCR检测正常肌肉组织、损伤后6小时肌肉组织和损伤后12小时肌肉组织中β—Actin等九种常用内参基因的表达水平，通过Normfinder、geNorm和BestKeeper三种软件分析九种常用内参基因在肌肉组织损伤后表达的稳定性，寻合适的内参基因。
5.54只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组和损伤组，建立不同损伤时间大鼠肌肉挫伤模型，提取总RNA、反转录后采用差异基因的上下游特异性引物进行Real—timePCR扩增，分析差异基因与损伤时间的关系。
结果:
1．采用Progema公司的SV Total RNA Isolation System提取的总RNA具有较高的RIN值，且没有DNA及蛋白质的污染。各样本RIN值在8.3～8.8之间，均大于8.0。每个样本都可见清晰的18s及28s峰，在18s峰之前基线平坦，没有降解的RNA片段出现。28s峰之后，基线也比较平直，说明没有基因组DNA及蛋白质的污染，可以保证后续验证实验的准确性。
2．经过对21条感兴趣的差异条带进行回收及再扩增，共有12条差异条带得到成功回收。DNA重组、转化及蓝白斑筛选重组成功的载体，经序列分析有5条差异条带片段较长，其他条带片段较短，多数为引物二聚体序列。
3．经过与GenBank进行同源性比较及Real—timePRC鉴定，5条差异性片段均从总RNA中得到了有效扩增，且溶解曲线均为单一峰型，说明均为阳性差异片段。其中3条为已知基因，与sTnI、Mx2及Cox6c匹配度较高，另外两条可能为新基因，有待于进一步研究。
摒弃精致的利己主义4．通过Real—timePCR的方法测定损伤后不同时间点肌肉组织中常用内参基因的CT值，经geNorm、Normfinder及BestKeeper软件分析，得出RPL13和RPL32在肌肉组织损伤后表达相对稳定，可以作为内参基因对目的基因进行均一化处理。而常用的β—Actin及GAPDH在不同损伤时间肌肉组织中表达不稳定。
5、经Real—timePCR分析，sTnI mRNA在损伤后表达逐渐降低，在0.5h、1h、6h sTnImRNA表达量分别为正常组的78.17％、41.58％、32.13％，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，6h～36h sTnI mRNA表达量与对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。Mx2 mRNA在损伤后0.5小时表达骤然升高达到正常对照组的84.3倍，随着损伤时间的延长，其表达量逐渐下降，损伤后18小时降低到正常对照组的0.65倍，在损伤后24小时又出现一个表达高峰，达正常对照组的37.1倍，随后又逐渐下降。Frag-3 m
RNA在损伤早期随着时间延长表达量逐渐增高，损伤后6小时其表达量高达正常对照组的243.5倍，损伤后12小时恢复到接近正常表达量水平，损伤后18小时，又出现一个小的表达高峰，为正常对照组的11.38倍，随后又下降至正常组水平。肌肉挫伤后Cox6c mRNA表达量的变化幅度较小，在正常组表达量的0.24～1.57倍之间。损伤后0.5小时，Cox6c mRNA表达量最高，为正常对照组的1.57倍。随着损伤时间的延长，其表达量逐渐减少，在1小时和6小时分别为正常对照组的1.29倍和1.19倍。损伤后18小时，其表达量已降至正常组水平以下，30小时表达量最低，为正常对照组的0.24倍。Frag-5 mRNA在肌肉损伤后36小时内均呈现相对高表达的状态。损伤的初始阶段其表达量迅速升高，0.5小时达到正常对照组的5.7倍，1小时达到一个高峰，为正常对照组的6.19倍。随后开始下降，12小时达到最低表达量，为正常对照组的1.2倍。在18小时达到又一个高峰，为正常对照组的8.6倍。
结论: 通过DDRT-PCR技术共发现5条差异性片段，其中三条与sTnI、Mx2及Cox6c的基因序列匹配度较高，另外两条可能为新基因。经实时荧光定量分析，sTnI、Cox6c mRNA相对表达量与损伤时间有关，随肌肉挫伤后时间的延长呈现规律性变化，且其变化幅度较小，速度较平稳，可以考虑作为损伤时间推断的标记。
4.期刊论文周瑞雪.蒙涛.赵发兰.成嘉.宾石玉.张建社.褚武英.Zhou Ruixue.Meng Tao.Zhao Falan.Cheng Jia.
Bin Shiyu.Zhang Jianshe.Chu Wuying草鱼MYH mRNA表达量分析中采用的内参基因稳定性比较-基因组学与应用
生物学2009,28(5)
本研究分别以β-actin、18S rRNA和GAPDH为内参基因，采用实时荧光定量PCR对草鱼早期发育时期肌球蛋白重链(myosin heavy light,MYH)基因的mRNA表达量进行分析，并比较不同内参基因对MYH基因mRNA表达水平检测结果的准确性.研究结果表明，以β-actin和GAPDH作为内参,MYH基因mRNA表达水平完全一致，其表达量从原肠到仔鱼阶段逐次递增，仔鱼与原肠期阶段相比表达量差异显著；当采用18S rRNA作为内参时,MYH基因mRNA在发育阶段的表达量呈不稳定状态.因此,β-actin和GAPDH均可作为内参基因，用于草鱼早期发育中MYH基因mRNA的相对定量研究：而18S rRNA作为内参时，可能会对检测结果造成偏差.本研究不仅准确的揭示了草鱼MYH基因mRNA的表达特征，并且为荧光定量PCR技术在鱼类基因表达研究方面提供了有价值的参考.
5.学位论文孙伟药剂胁迫下朱砂叶螨酯酶基因的表达特征2010
朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种为害严重而又难以防治的重要农业害螨，在
我国分布广泛，对包括棉花、多种蔬菜在内的许多植物都有危害。该螨世代周期短，繁殖力
强，近亲交配率高，受药机会多，很容易产生抗药性。
酯酶作为一种水解酶，能够水解羧酸酯键和磷酸酯键，代谢多种含有酯键的杀虫剂，是徽州商王
害虫产生抗性的主要因素之一。
本研究在前人已经克隆得到朱砂叶螨酯酶基因TCE1,TCE2的基础上，建立了适于定量
检测朱砂叶螨mRNA表达的real-time PCR方法，并用该方法检测了酯酶基因TCE1和TCE2
的mRNA分别在朱砂叶螨不同发育时期(卵、幼螨、若螨和成螨)、不同品系(阿维菌素、
、氧化乐果抗性品系和敏感品系)以及药剂(阿维菌素、、氧化乐果)诱
导前后的表达差异，从基因水平探讨了朱砂叶螨酯酶基因的表达变化与其抗药性形成之间的
内在联系。此外，还成功构建了酯酶TCE1，TCE2基因的重组原核表达载体pET43a-TCE1，
pET43a-TCE2，且在E.coli Transetta中成功进行了蛋白表达。本研究获得的主要成果如下：
1.利用RT-PCR技术，从朱砂叶螨体内获得了七条候选内参基因的扩增片段，并提交到
GenBank，取得相应的登录号分别为RPS18(FJ608659)：262bp，5.8SrRNA(FJ526334)：470bp，
GAPDH(FJ526335)：293bp，RPL13a(FJ608662)：242bp，TBP(FJ608661)：365bp，SDHA
(FJ608660)：594bp，α-TUB(FJ526336)：962bp。采用实时荧光定量PCR方法并使用geNorm和
NormFinder两个软件共同筛选最适合朱砂叶螨的内参基因。内参基因筛选结果为：5.8s rRNA，
α-TUB，RPS18，GAPDH，RPL13a,β-actin表达稳定度的平均值M在不同品系中依次为0.381，
0.449.0.352，0.460，0.445，0.643，表达稳定度由高到低排序依次为RPS18＞5.8srRNA＞
RPL13a＞0.449＞GAPDH＞β-actin；M值在不同螨态中依次为0.762，0.555，0.537，0.855，
0.574,0.768，表达稳定度由高到低排序依次为RPS18＞α-TUB＞RPL13a＞5.8srRNA＞β-actin＞
GAPDH。再通过NormFinder软件计算各内参基因的稳定度值，最终确定了在不同品系朱砂
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