郭广君1吕素芳1沈志强1王荣富2
（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州256600
2.安徽农业大学生命科学学院，合肥230036）
摘要Ca2+是多种信号途径的第二信使，钙信号的转导在整个真核生物信号转导中发挥重要作用。近年来，胞质自由Ca2+的浓度变化的原初位点、钙信号的表现形式及Ca2+靶蛋白在发挥生物学功能的构象效应方面已成为生命科学中的研究热点。钙信号途径下游的Ca2+靶蛋白——钙调素（CAM）和钙依赖的蛋白激酶（CDPK），前者在整个生物界细胞中都存在，后者在高等动物中没有发现，而只在植物、藻类、部分原生动物存在。 关键词Ca2+，钙信号, 钙调素, 钙依赖的蛋白激酶, 非密封接膜片钳
游离Ca2+是细胞内重要的第二信使，参与多种生命活动的调节。Ca2+在细胞外、胞浆、细胞核内起着重要的调节作用，生物的许多重要的生理过程，如：对各种外界刺激的响应、物质的跨膜运输、代谢调节、细胞有丝分裂、基因的转录与表达和细胞的调亡等均受到胞内外Ca2+浓度变化的调节和调控。因此，需要测定胞质自由Ca2+的浓度变化水平。目前已有几种较好的测定方法，如：荧光指示剂法、重组
水母发光蛋白测定法、非密封接膜片钳法等。胞质自由Ca2+浓度的变化包括瞬时增加、持续变化和振荡，主要是通过存在质膜及细胞内膜上Ca2+通道（Ca2+channel）与Ca2+泵（Ca2+pump）及Ca2+/H+反向转运子（Ca2+/H+ antiporters）的作用来实现。另外，近几年来，对Ca2+信号途径的下游Ca2+的靶标和引起的生物学效应有了更加深入的了解。
1.Ca2+研究方法唯美主义运动
1.1胞内Ca2+浓度的测定方法
1.1.1Ca2+荧光指示剂就非转基因生物材料而言，测定胞内Ca2+浓度主要是利用荧光指示剂。Ca2+荧光指示剂中，indo－1、fura－2、quin－2、fura－4f、fura－5f、fura－6f、BTC 等由紫外光所激发；fluo－3、rhod－2、calcium green－1 、calcium green－2、calcium orange、calcium crimson、fura red、calcein等由可见光所激发。对于动物细胞和植物细胞的原生质体，常温下将酯化的荧光指示剂导入细胞即可；但是对于完整的植物细胞，由于细胞壁的存在，细胞壁酯酶活性较高，荧光指示剂经常在壁区被水解或进入胞内后脂质基团不能完全被水解而难于应用。目前有几种方法使得这一问题得到解决：（1）低温下（如4℃）孵育，以降低
细胞壁酯酶活性，然后在常温恢复一段时间，使进入细胞的酯化的荧光指示剂被水解。（2）酸化（PH 4.5），并加辅助扩散物质pluronic F－127，可将fura－5的钾盐在常温下载入拟南芥保卫细胞[1]。
空中舞星（3）电击法或微电极法导入，并与激光共聚焦显微术相结合，可获得比较理想的结果。测定脂质Ca2+浓度的Ca2+荧光指示剂有fura－C18和calcium green－C18。近浅海观测网
1.1.2重组生物发光蛋白水母发光蛋白(aequirin) 是一种与Ca2+结合后发出蓝荧光的蛋白，与Ca2+结合后发出的荧光强度，在0.1－10μM/L Ca2+浓度范围内，与Ca2+浓度呈正相关。Igor D等[2]将脱辅基水母发光蛋白的基因编码区与CMV(花椰菜病毒)35s启动子联合构建成嵌合基因，然后导入烟草幼苗，使其在F1、F2代持续表达，F2代幼苗在浸泡时加入辅基后即可用来测定整株植物各部分细胞质内自由Ca2+浓度。
1.2膜片钳（patch－clamp）和非密封接膜片钳（loose－patch）膜片钳技术是利用一个玻璃微吸管电极完成膜片或全细胞电位的监测、钳制和膜电流的记录，通过观测膜电流的变化来分析通道个体或体的分子活动，探讨离子通道特性[3]。目前已经能够记录到质膜Ca2+浓度变化，并可测定在外界刺激、正常生理或病理条件下的Ca2+流大小的改变。更重要的是能与荧光探针钙图像分析技术相结合，来研究Ca2+浓度与质膜Ca2+或其它离子流之间的关系。
2.钙信号表征（expressional characteristics of calcium signaling）
细胞对应的某一刺激所产生的Ca2+浓度的时空变化方式，称为钙信号。不同的外界刺激、内部生理条件下，细胞内Ca2+变化的部位和时间特征不同，特异性的Ca2+变化决定生理反应的特异性。我们把
这些细胞内Ca2+变化及其引起的生理变化的特征称之为钙信号表征。
2.1钙火花（calcium spark）和钙火星（calcium sparklet）钙火花是指细胞内钙的自发的、局部的、非传播性增高的现象。在激光共聚焦显微镜下已发现从心肌细胞肌质网内释放的钙可在细胞内产生局限性的、类似点火花状的自发性增高，因而称之钙火花。这种局部的钙增高，可见于静息状态的心肌细胞，由肌质网的钙释放通道自发的将钙释放出来。自从Neher和Sakmann在上世纪七十年代末建立起膜片钳技术以来，单个离子通道的活动可以用电学方法实时记录。这种方法中，用于记录离子电流的玻璃微电极会导致细胞膜局部形变，许多实验室发现在膜片钳条件下，细胞膜的Ca2+通道失去了对心肌肌质网Ca2+的释放的有效控制，不能触发细胞内单位Ca2+释放事件－钙火花（calcium spark），这成为兴奋收缩耦联的功能研究深入到分子水平的主要障碍。王世强、程和平等[4]于1993首次在激光共聚焦
显微镜下发现心肌细胞内钙释放的基本单位－钙火花，并从1999年起着手对这一前沿问题进行研究。他们首先探讨是否有可能用荧光探针来探测流过单个钙通道的Ca2+信号，结果表明：当单通道离子流被一种激动剂加强后，在阈刺激条件下能够探测到由少数Ca2+通道活动产生的局部钙荧光信号，并且这种信号比细胞内Ca2+释放产生的钙火花小一个量级。因而将其命名为钙火星（calc ium sparklet），接着用膜片钳的方法对其定量鉴定，证明钙火星在时间和幅度上与单个钙通道离子电流成正比。后来，用非密封接膜片钳（loose-patch）和激光共聚焦显微镜合成技术记录到高幅度的钙火花
和低幅度钙火星两种局部钙信号，其中钙火花总是在钙火星的基础上发生，没有钙火星则钙火花不能发生[5]。诱发钙火花的幅度高于自发钙火花的幅度，而空间范围的情况则相反[6]。诱发钙火花在幅度和上升速率上具有多态性[7]。
2.2 钙波（calcium wave）钙波是细胞内部Ca2+在细胞内某一个位点开始升高，并从该位点沿着一定方向向周围扩散的现象。在某些刺激下，Ca2+通过钙通道流入细胞质，胞质Ca2+水平增加到一定程度后，Ca2+通道关闭，Ca2+泵（Ca2+－A TPase）将胞质中Ca2+运回到胞内Ca2+库和细胞壁中，结束信号[8]。某些刺激引起细胞内产生IP3，细胞内钙库膜上对IP3敏感的钙离子通道带有两个位点：IP3结合位点和Ca2+结合位点。在Ca2+浓度较高的条件下，此通道的开放对IP3浓度的要求很低；而IP3浓度较高时，只要有少量Ca2+存在即可。当一个IP3依赖性通道开放后，通道周围的Ca2+浓度的增加促进附近其他通道的开放，从而形成了钙波。IP3敏感性通道位于膜上，因此钙波的移动位于细胞中膜系统的表面。许多钙依赖性蛋白（如CaM和Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶）均结合于膜表面。钙波经过时这些蛋白被激活，诱导产生钙信号的下游事件，如K+、Cl-通道的开放和钙依赖的基因表达等[9，10]。2.3 钙振荡（calcium oscillation）生物细胞在一系列生理及非生理刺激的条件下表现为胞质Ca2+浓度重复性的增加，称为钙振荡[11]。钙振荡是由细胞内钙库的持续性充盈和排空引起的。钙振荡使钙信号可以用振幅和频率信号双重编码，钙振荡方式与外源刺激的类型和强度有关[12]。McAinsh等[13]提出：Ca2+振幅和频率信号的双重编码和解码机制包括了一个Ca2+依赖型磷酸酶的活动及一个
不依赖Ca2+的蛋白激酶的活动。Ca2+振荡主要影响Ca2+活化的磷酸酶的活性，因此特定靶蛋白的磷酸化程度就上下波动，但对激酶活性没有影响。低频率振荡时靶蛋白处于磷酸化状态，而高频率振荡时靶蛋白则处于非磷酸化状态。这种特异性的Ca2+振荡模式转化为特异的磷酸化水平，从而引发下游的一系列生物学反应。
3.钙信号空间定位
Ca2+浓度变化可以来源于细胞外基质、内质网、线粒体、液泡、叶绿体等，钙信号也可定位于细胞质、细胞核及核周围、叶绿体基质等不同细胞部位。高等动物肌质网也是钙信号产生的主要部位。结瘤因子激发的钙信号产生于细胞核区域，而与根毛生长相关的钙信号则发生于根毛顶端[14]。在生物细胞中，由于外界刺激而产生钙波，而钙波引发了由IP3诱导的Ca2+的释放[15]。Laurence S等[16]在非洲爪蟾卵母细胞中，发现线粒体Ca2+浓度的增加是IP3诱导的Ca2+释放的重要因素，揭示了线粒体在细胞内Ca2+信号传导中担当重要的角。Y an Li等[17]首次观察到神经细胞外的导向因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）能打开非选择性阳离子通道(transient receptor potential canonical,TRPC)，导致神经纤维最前端生长锥内的钙离子浓度增加，进而引导神经纤维朝BDNF浓度高的一侧生长。而生长锥内的Ca2+浓度的增加主要是由细胞外基质的Ca2+内流和内质网（endoplasmic reticulum, ER）钙库中的Ca2+释放引起的。
4.钙信号的靶蛋白及其生物学效应
4.1 钙调素（Calmodulin, CaM）CaM是一种高度保守的多功能Ca2+结合蛋白，它广泛存在于真核生物细胞中，至少有30多种靶蛋白和靶酶。CaM本身没有酶活性，与Ca2+结合调节细胞内、外一些靶蛋白的活性，是细胞内Ca2+信号传导途径中主要信号转导分子，介导调控由Ca2+引起的一系列生理生化反应，参与并调控细胞的分裂、增殖、分化、运动等基本代谢过程[18]。
CaM是由19种氨基酸组成的小分子单链多肽（148个氨基酸残基，相对分子质量17，000），热稳定，富含酸性氨基酸，等电点（PI）约4.0。结合Ca2+的钙调素（Ca2+/CaM）是一个哑铃状分子，其两端是结构较为致密的球形区域，各含有2个同源性Ca2+结合位点，中间由一段柔性的中心螺旋连接。每一个Ca2+结合位点两侧都由一段α螺旋包围，形成螺旋－环－螺旋（helix-loop-helix）结构，Ca2+被结合在天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）12个残基之间的β片层环中，这种基本结构被称为EF－hand结构，它是钙结合蛋白超家族的共同特点。
在高等动物中有多种CaM基因，但它们编码的CaM蛋白具有完全一致的氨基酸序列；而植物中发现的多种CaM基因，它们编码相同或相似的CaM蛋白，把这些CaM及其相似蛋白称为CaM亚型（isoform）[19，20]。CaM亚型的氨基酸组成变化可能使其与不同的靶蛋白相互作用，从而完成不同的生理学功能。Lee等[21－22]的研究表明：ScaM－1和ScaM－4 CaM靶酶：NAD激酶和磷酸二酯酶、肌球蛋白轻链激酶（myosin light-chain kinase, MLCK）、
CaM依赖性蛋白激酶（CaM-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ）、动物和植物的Ca2+－A TPase、植物谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase, GAD）的激活特性存在很大差异，并且前者高于后者。而对于相同的靶酶，两者存在竞争性结合的拮抗激活调节。Cho等[23]证实：ScaM－1在12nmol·L-1时能激活哺乳动物的钙调磷酸酶（calcineurin, CaN）最大活性的50％，而ScaM－4在70nmol·L-1时对CaN活性起拮抗作用。相反，ScaM－4在180nmol·L-1时能激活一氧化氮合成酶（nitric oxid synthase,NOS）最大活性的50％，而ScaM－1在120nmol·L-1时对NOS活性起拮抗作用。Heo等[24]发现，当大豆受大豆叶斑菌杆菌(Pseudomonas syringaepv, glycinea)或病原激发子侵染30min即可诱导ScaM－4和ScaM－5基因的表达，而其他CaM亚型不被诱导表达，并在转ScaM－4和ScaM－5基因烟草中发现对多种病原菌具有很强的抗性，能自发形成病斑和诱导产生系统性抗性。孙大业等[25－28]研究表明: CaM在细胞外普遍存在，并发挥多种生物学功能，如促进细胞增殖、促进原生质体细胞壁再生及第一次分裂、启动、促进花粉萌发和花粉管伸长等。并提出Ca2+激活的细胞外CaM可能作为一种多功能多肽信使在植物生长发育过程中发挥重要作用。
4.2钙依赖的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)CDPKs是一种依赖Ca2+的蛋白激酶[29]，它不同于动物细胞中的蛋白激酶C和依赖于Ca2+/CaM的蛋白激酶，是Ca2+信号重要的初级感受器。它在植物、藻类及部分原生生物中均有存在，但在细菌、真菌、酵母、线虫和高等动物中尚未发现[30]。
CDPKs为单肽链，分子量一般为40－90KD，在结构上具有明显的特征，从N端到C 端存在四个功能区（结构域），依次为可变区、催化区、连接区和调控区。
红糜N V Kinase J CaM－LD C
CDPK
EF hands
CCamK
CRK
可变区催化区连接区调控区原型批评
V ariable Kinase Autoinhibitory Calmodulin-
fspdomain domain domain like domain
图1 CDPK, CCamK, CRK的结构差异
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议