毒理学杂志2020年10月第34卷第5期J Toxicol October2020Vol.34No.5•385・中图分类号:R735.8文献标识码：A文章编号：1002-3127(2020)05-0385-04•实验研究•紫草素调控PKM2/STAT3信号通路抑制RBE细胞转移的研究 邓秋媛'，刘志坤？，乔静'
(1.华中农业大学医院，湖北武汉430070；2.河北医科大学第四医院，河北石家庄050035；
3.青岛大学附属医院，山东青岛266100)
【摘要】目的探讨紫草素对人肝内胆管癌RBE细胞转移的效果研究。方法培养人肝内胆管癌RBE细胞，MTT实验检测紫草素对RBE细胞增殖的影响；流式检测紫草素对RBE细胞凋亡的影响；划痕实验检测紫草素对RBE细胞侵袭的影响;Transwell实验检测紫草素对RBE细胞转移的影响；蛋白质印迹分析实验检测M2型丙酮酸激酶(PKM2)、信号传导与转录激活因子3(STAT3)、磷酸化信号传导与转录激活因子3(p-STAT3)、钙粘附蛋白E (E-cadherin)、钙粘附蛋白N(N-cadherin)蛋白表达「结果随着紫草素浓度的增高.RBE细胞活力逐渐下降.凋亡逐渐增加；侵袭能力逐渐减弱，转移能力逐渐减弱，PKM2、STAT3、p-STAT3、E-cadherin和N-cadherin蛋向表达水平下降。结论紫草素通过调节PKM2/STAT3抑制RBE人肝内胆管癌细胞转移”
【关键词)紫草素；肝癌；PKM2/STAT3；转移
Shikonin inhibits RBE cell migration by regulating PKM2/STAT3
signaling pathway
DENG Qiu-yuan1,LIU Zhi-kun2,QIAO jing'
(1.Huazhong Agricultural University Hospital,Wuhan Hubei430070,China； 2.The Fourth Hospital of
Hebei Medical University,Shijiazhuang Hebei050035,China； 3.Affiliated Hospital of Qingdao
University,Qingdao Shandong266100,China)
[Abstract]Objective To investigate the effect of shikonin on the metastasis of human intrahepatic cholangiocarcinoma RBE cells. Methods Intrahepatic cholangiocarcinoma RBE cell line was cultured and MTT assay was used to detect the effect of shikonin on RBE cell proliferation.Scratch test was used to detect the effect of shikonin on RBE invasion.Transwell test was used to detect the effect of shikonin on RBE transfer.The expression of PKM2,EGF,EGFR,E-cadherin and N-cadherin was detected by Western blot.Results With the increase of shikonin concentration,the activity of RBE cells gradually decreased,apoptosis gradually increased,the invasion ability gradually weakened,the metastasis ability gradually weakened,and the expression level of PKM2,EGF,EGFR,E-cadherin and
陈火军N-cadherin protein decreased.Conclusion Shikonin can inhibit RBE human intrahepatic cholangiocarcinoma cell metastasis by regulating PKM2/STAT3.
[Key words]Shikonin；Liver cancer；PKM2/STAT3；Metastatic
肝癌是一种高度侵袭性肿瘤，常伴有远处转移，这是其预后不良的主要原因。因此，肝癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡率的第二大原因⑴。肝内胆管癌是肝癌的一种，近年来其发病率有所增加，在上尚未取得令人满意的疗效⑺。放疗和化疗是目前最主要的术后辅助方法，然而效果差，副作用也很明显，患者经常在在过程中产生耐药性⑴。因此.阐明肝癌发展的精确分子机制和开发新的靶点是重要的。
基金项目：国家自然科学基金(81870615)
作者简介：邓秋媛.硕士.主治医师.研究方向：消化道肿瘤.
通讯作者：刘志坤.博士.主任医师.教授.研究方向：恶性肿瘤的放疗及基础研究。
许多类型的癌细胞需要增加葡萄糖的摄取，但是即使有氧气存在，氧化磷酸化也会减少。这种有氧糖酵解增加乳酸产量的现象被称为瓦博哥效应。丙酮酸激酶(PK)将磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸.是糖酵解途径中的限速酶之一⑷。它有4种已知的亚型，分别是Ml型、M2型、左旋型和右旋型。研究发现，
M2型丙酮酸激酶(PKM2)为肿瘤的增殖、转移提供了优势⑸。有研究发现PKM2可以通过磷酸化信号转导和转录激活因子3(STAT3)蛋白促进癌细胞的转移⑹。因此，PKM2的表达对癌细胞的生长很重要。
紫草素是从中草药植物-紫草中提纯的，几千年来一直被用于烧伤、痈、麻疹、黄斑疹和咽喉痛"叫最近的研究表明，紫草素具有明显的抗肿瘤潜
•386•奉理学杂志2020年10月第34卷第5期J Toxiwl October2020Vol.34No.5
力，在包括乳腺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤和白血病在内的各种类型的癌细胞系中诱导凋亡和坏死性下垂“。有研究报道紫草素通过影响线粒体功能促进肝母细胞瘤死亡。然而，关于紫草素对肝内胆管癌细胞的影响仍然未知。因此，本研究采用紫草素肝内胆管癌RBE细胞，观察其对细胞凋亡及PKM2/STAT3蛋口表达的影响，从而探讨紫草素对肝内胆管癌细胞的影响及PKM2/STAT3信号通路的作用。
1材料与方法
1.1材料来源紫草素购自美国MCE公司，纯度99%。唾醴蓝（MTT）、RPMI-1640培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液购自上海赛默飞世尔有限公司。R1PA裂解液、细胞凋亡试剂盒来自南京建成公司。Transwell chamber来自上海宇博生物技术有限公司。人肝内胆管癌RBE细胞系来自中国科学院上
海细胞库。凝胶成像系统来自美国热费希尔科学公司。多光谱微孔板阅读器由美国生物拉德实验室公司提供。抗体来自于英国abeam公司。
1.2细胞培养在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37七和5%C02下培养人肝内胆管癌RBE细胞。培养基每周更换2次，在对数生长期收获细胞用于随后的实验。
1.3MTT法检测细胞抑制率在对数生长期收集细胞，接种到96孔板中，密度为1x107个/孔，每孔200口。细胞在37T和5%C02的培养箱中培养2d。细胞粘附后，加入0（对照组）、5、50和500nmol/L（组）的紫草素处理细胞。在37£和5%CO?下培养3d后，弃去液体，向每个孔中加入8山MTT。细胞继续培养4h后，终止培养。4七，1800x g离心5min 后，弃去培养物的上清液，向每个孔中加入150口二甲基亚砚。用酶标仪检测每个孔的吸光度，计算细胞抑制率和IC50值。
1.4流式细胞术在对数生长期收获细胞，并将细胞密度调节至5X105个/ml。然后将1ml细胞加入6孔板中。细胞粘附后，用含0、5、50和500nmol/L紫草素的培养基代替原始培养基。在细胞培养24h后，收集细胞并染，随后用流式细胞仪（美国FACSCalibur 生物科学公司），以测量细胞凋亡率和细胞周期。
1.5Transwell试验将Transwell小室放置在24孔培养板中，将少量无血清培养基加入上部室，随后加入基质胶。上腔室加入400|xl细胞悬液（5X104个细胞/L），下腔室填充含有10%胎牛血清的500口细胞
培养基。细胞在正常条件下培养24h后，收集Transwell小室并用甲醛固定，然后用0.1%结晶紫染。在显微镜下随机选择10个视野，计算穿透细胞膜的细胞平均数量。
1.6划痕实验将1x10'个/细胞接种到6孔板中，并在正常条件下培养。当细胞处于对数生长期时，使用规格为100M的头在孔板中划线并在显微镜下拍照。随后将正常培养基更换为紫草素浓度为0、5、50和500nmol/L的培养基继续培养24h后并在显微镜下拍照。
1.7蛋白质印迹分析检测PKM2等蛋白的表达根据RIPA提取说明书，使用RIPA溶液从细胞中提取总蛋白。蛋白质浓度用BCA法测定。用5%脱脂牛奶封闭1h后，将膜与一级抗体在4t孵育过夜。用TBST 洗涤5minx3次后，将膜与二级抗体在室温孵育1h。化学发光法用于检测抗体信号，信号由凝胶成像器扫描检测。
1.8统计学方法统计分析采用SPSS17.0软件分析。多组间的比较采用单向方差分析和事后检验。细胞活力检测、凋亡率、侵袭迁移采用t检验。蛋白质印迹分析采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1紫草素对RBE细胞活性的影响MTT实验结果发现紫草素处理24h后，细胞活力明显受到抑制，且具有剂量依赖性。（P<0.05；图1）。
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紫草素(nmol/L)
注：各组间比较••/><0.05。
图1各组细胞活力结果比较
2.2紫草素促进了RBE细胞凋亡如图2所示，流式细胞仪检测发现紫草素明显促进细胞凋亡（P<0.05）o随着剂量的增加，紫草素处理的细胞凋亡率明显增加。5nmol/L紫草素凋亡率明显高于0nmol/L紫草素；50nmol/L紫草素的凋亡率明显高于5nmol/L紫草素，500nmol/L紫草素的凋亡率明显高于50nmol/L紫草素（P<0.05；图2）
。
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紫草素(nmol/L)
图2各组细胞凋亡结果比较
2.3 紫草素减弱了 RBE 细胞侵袭迁移的能力划痕
实验结果显示，随着紫草素剂量的增加，划痕间距逐渐 增多（PvO.05；图3）。Transwell 试验结果显示，随着
紫草素剂量的增加，渗透到小室膜的细胞数量明显减 少（P < 0. 05 ） o 5 nmol/L 紫草素细胞数明显低于
0 nnwl/L 紫草素；50 nmol/L 紫草素的细胞数明显低 于5 nmol/L 紫草素；500 nmol/L 紫草素的细胞数明显 低于 50 nmol/L 紫草素（P<0. 05；图 3）。
2.4 紫草素降低了 PKM2/STAT3的表达通过蛋白
质印迹分析检测紫草素对PKM2等表达的影响。如图 4结果显示，随着紫草素剂量的增加，PKM2、EGF 、 EGFR x E-cadherin 和N-cadherin 蛋白水平逐渐减少。
3讨论
肝内胆管癌作为最常见的原发性肝癌之一，其发
病率在全世界内也正在上升。紫草素是从中草药植 物-紫草中提取的一种天然蔡醍化合物，目前已用于
烧伤和骨盆疼痛等疾病"°】。随着研究的深入，国 内外很多科研机构发现紫草素在防治肿瘤方面有重要
的功能。为了探索紫草素对肝内胆管癌的作用机制，
研究人员使用紫草素人肝内胆管癌RBE 细胞，观 察其对RBE 细胞凋亡、转移及PKM2、STAT3蛋白表
0 550
500
紫草素(nmol/L)
0 5 50 500
紫草素(nmol/L)
紫草素(nmol/L)
5
50
500
注：A 为各组细胞划痕实验结果比较；B 为各组细胞Transwell 实验结果比较；各组间比较，字<0.05；各组间比较，•“PcO.OOl 。
图3各组细胞划痕实验和Transwell 实验结果比较
达的影响。
肿瘤死亡过程受阻是肿瘤发展的重要原因W
因此，促进肝内胆管癌细胞凋亡可以达到效果。 已有研究报道发现紫草素可以诱导肝母细胞瘤细胞发 生凋亡⑴）。与此一致的是，研究人员通过MTT 实验发
5 50 500
紫草素（nmol/L ）
各组间比较，"P<0.0l ：现，随着紫草素剂量的增大，肝内胆管癌RBE 细胞活力 逐渐下降。此外，流式结果发现紫草素也可以诱导肝内
胆管癌细胞发生凋亡，且具有剂量依赖性。这说明紫草 素有望成为肝内胆管癌的一种新型药物。
肝内胆管癌细胞转移是导致患者死亡的重要原因
。
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注：各组内比较，字<0.05；各组内比较,-P<0.01； 各组间比较，・”p <o .ooi 。
图4各组细胞蛋白质印迹实验结果比较
因此，抑制癌细胞转移将会大大提高患者生存率。研究 人员通过Trallswell 和划痕实验发现随着紫草素浓度的
增加，RBE 细胞转移能力减弱。与此一致的是，本研究 通过蛋白质印迹分析结果发现随着紫草素浓度的增加， 转移相关蛋白E-Cadherin 、N-Cadherin 表达也逐渐减少。
已知PKM2/STAT3是引起癌细胞侵袭转移的经典信号 通路:⑶。Ma 等（⑷发现PKM2可以通过促进STAT3的 磷酸化诱导食管鳞状细胞癌的转移。STAT3是STAT
家族成员之一，在各种癌症中被激活〔⑼。STAT3酪氨 酸被磷酸化后，具有转录因子活性。然而，紫草素在肝
内胆管癌中是否通过PKM2/STATA3信号通路发挥作
用未被发现。因此，研究人员通过蛋白质印迹分析结果
发现紫草素导致P-STAT3表达水平减少，STAT3蛋白总
量表达水平不变，PKM2表达减少。由此，研究人员推 测紫草素可能通过PKM2/STAT3信号通路抑制肝内胆豹团网
管癌RBE 细胞的转移。
综上所述，紫草素具可能通过PKM2/STATA3信
号通路抑制肝内胆管癌RBE 细胞的转移。参考文献
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(收稿日期：
2020-03-06)
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