第9卷第3期中围兽医寄生虫病V01．9 Nf)．3
2。。1年7月Cbl—e JournH{d Vet erl na’y P a r a s l t o l o g y JuL 200l CpG基序的作用机理及其在寄生虫学上的应用 傅志强，刘金明
安徽省委员会(中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所，上海市200232)
摘要：(：PG ODN是指一些台有未甲基化的(：p(二二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸，县有较强的免疫教治能力。本文 就CpGODN的研究背景、作用机制进行了综述，并介绍了它在寄生虫学上的应用。美键词：(：pG；免疫激活；机
理；寄生虫学
中图分类号：s852．7 文献标识码：A文章编号：10050868(2001)03。。4205
cp G基序(cp G nl ot if)是指一些具有较强免疫性。后来越来越多的研究证实r这个结论。Ya—激活功能的以未甲基化的cpG为核心的寡聚脱氧maⅡ10to等““的研究表明，1】种细菌、病毒、元
脊椎核苷酸(。ligode。。ynucleotides，ODN)‘“。研究发现．动物的DNA都能提高BALB／c小鼠的NK
细胞的cp G序列能在动物体内诱生强烈的免疫反应，主要裂解活性和I F N～7的分泌水平。I F N7 激活巨噬细
包括：激活B细胞增殖、分化，分泌白细胞介素一6胞，IFN‰1FN p抑制病毒生跃。而10种脊椎动物(IL一6)和免疫球蛋白(IgM、IgG2a)，诱导抗抗体诱(包括3种鱼、5种哺乳动物)的D NA则投有这种
活生的细胞凋亡(aI lt件I gM—j nd uc ed apoptosis)‘2’“，并性。他们认为含c p G基序的特异重复序列是这种免
诱导单核细胞分泌白细胞介素12(IL一12)和其它细疫活性作用的核心，并且通过不同基因的克隆和人
胞因子“5，活化自然杀伤细胞(NaturalKillercell．工合成30个碱基的单链寡核苷酸等方法研究证实：
NK cell)的裂解活性，分泌7干扰素(interf eron 7，具有免疫激活作用的寡核苷酸的特异序列是：
IFN 7)o’71”，诱导细胞免疫反应口3等，表现强烈的G ACGTC、AGCGC T、AAC GTT，而不是ACCG TH】型免疫反应。研究人员推测：c p G序列所产生GTll ．的强烈迅速的免疫效应可能是cpG基序
和细胞内在大多数细菌基因组DNA中，未甲基化的
特异的分子受体相结合，从而激活r生物体内的先c p G二核昔酸的出现频率和理论计算值是相等的，
天性免疫保护机制，引发机体对外源微生物的免疫大约是l／16，丽在脊椎动物等真核生物D N A中，
反应所致o]。基于c p G基序的特殊性质，随着研究c pG二核营酸大部分是甲基化的[。一，即在胞嘧啶c 的不断深入，它的应用前景是十分光明的。的57位甲基化，形成5‘mc(易突变为胸腺嘧
啶
T)__1，未甲基化的cpG：二核苷酸的出现频率只有理
】CpG基序研究的背景介绍
论值的1／4。这就是脊椎动物DNA中存在的cpG 研究生物学家普遍接受脱氧核糖核酸(DNA) 抑制现象(CpG supprcssi。n)mj。是生命的遗传物
质这样的观点，而对DNA作为信机体细胞内的模拟识别受体(pa ttern reco g ll iz e
号转导分子，具有免疫调控作用的观点则没有形成r ec印tor，PRR)正是靠和特殊序列中的未甲基化的
共识。在细菌等大多数微生物中DNA占了其总量c pG二核苷酸的特异性结合来区别是细菌DN A、
的一半多，虽然T)NA是一类被普遍认为只有较弱其它无脊椎动物DNA还是自体D NAD]。从以上
这免疫原性的物质，但在极大的竞争压力下高度优化些结果推测：未甲基化的c p G序列町能是激发脊椎
的哺乳动物的免疫系统对由DNA类物质(特别是动物的先天性免疫保护机制，来抵御以细菌为主的
细菌、病毒等原核生物的D N A)诱导产生免疫反应外源病原体的入侵。
的可能性还是很大的。
2 CpG基序免疫激活的细胞和分子
1984年T ok an a ga等““第一次报道牛结合分
支杆菌(^8f。妊mri“优6删zs strai n，Bc G)提取物中机制
的DN A类物质在皮内注射时激活机体的抗肿瘤活c pG0DN的免疫激活功能一经发现，就吸引
万方数据影响食品安全的因素
第9卷第3蝴傅志强等：(：p(；基序的作用机理及其在寄生虫学上的应用
许多生物学家去探索它的可能的免疫激活的细胞和N F kB主要促进I L 12的表达““。II，12激活自然杀分子机制。在LIANG等““进行的研究中，将有细胞伤细胞分泌7IFN，并在THl辅助T细胞协同作
用激活特性韵硫代磷酸酯寡聚核苷酸(p hosp hor oth下激活细胞毒T淋巴细胞，呈现细胞免疫反应效ioate oiigodcoxynucIeotides，s0DN)和琼脂糖凝殷应““。但也有研究表明，存在一条和IL 12无关的(sep}·arose beads)结合后与未结合的sODN激话B途径涛导THl型细胞因子分泌，抑制TH2型细
胞细胞的效率是相似的，因此他们认为cpG()DN是因子分泌，而和I L 10、B7．1及c D一40蛋白的分泌和未知的细胞表面受体结合。但也有研究发现，cpG 相关‘2 。受体是细胞内的，cpG确定被固定不能被细胞吸收在c pGO DN作用B细胞后，NF kB促进I L 一6后，c p G就没有免疫激活作用了。在M a n z e l和和19M抗体的分泌并促进B细胞的增殖、
分化““。Macfar la ne“”的实验中，当cp G()DN和包被于胶并且在THl辅助T细胞、抗原提
呈细胞的协助下，乳、磁珠、金、琼脂糖珠(“garose beads)的链亲和索分泌抗体IgG2a．呈现
一种抗体类型转换(19M to (streptavid in)结合时，不能支持7T Dl细胞生长(一IgC class switch)02”。
种需要cpG ODN或II。一6才能生长的鼠杂交瘤细cpG ODN和另一类免疫增强剂脂多糖(LPs) 胞，而链亲和素cpG复合物则对7TDl细胞生长没诱导免疫反应的机制可能是不同的。cpG oDN和有影响。用荧光cp G ODN共价结合于溴化氰活化脂多糖都可以诱导相似水平的NFkB进入细胞核的琼脂糖凝胶和7TDl细胞共孵育后，能在细胞内中．但L P s诱导I L12 P d o转录较弱，并且加入观察到荧光现象。他们认为cpG()DN被细胞内化IFN一7后，cpG ODN比f．Ps可以诱导更多的IL一12 是其免疫激活作用所必须的。Yamamoto口63等的研P40的分泌，睦；|此他们认为，Cp G OD N和LP s的根究表明，cp G在被细胞吞噬吸收后才有免疫激活的本区别是各自诱导IL 12 P40分泌的机制不1刮2“。功能，细胞在吸收DNA时是没有序列特异性的，面奎纳克林、氯喹等结构相关化合物能抑制cpG 在激活机体的免疫反应时需要cpG基序。奎纳克林ODN的免疫激活作用，而不能抑制L P s诱导的免
(quinacriIle)、氯喹(chloroquine)及结构相关化合物疫反应“州，有力地佐证了cpG ODN和LPs诱导
免(structLlraily rel a t e d compoullds)等药物能通过特疫反应的机制是不同的这-观点。异性干
涉寡核苷酸的内体融台、酸化的过程来完全
3 CpG基序在寄生虫学上的应用
特异性地抑制cpG()DN的免疫激活作用，也支持
了cpG受体是细胞内的假设“”。即使这样，依然有cpG 0DN受体在细胞内的位置暗示，cpG 可能在细胞表面存在特异性的受体，在cpG O D N()DN可引发对细胞内的细菌、病毒、逆转录病毒等的细胞内化过程中发挥特殊的作用n]。的免疫防卫反应，由于这些病原体的桉酸最容易接虽然cpG受体的确切结构甚至确切的定位依近c p G0DN模拟识别受体”J。特定的细胞内寄生然未能弄清，但是对cpG 0DN的所诱导的免疫活虫也是这样。还没有报道cpG o D N对细胞外微生化效应的机制和结果已有很多报道。在接触cpG
物侵袭有显著作用的保护力。cpG ODN在许多疾OD N 20～30分钟以后，B细胞、巨噬细胞病的防治和应用研究方面已取得了进展。虽然CpG (macrophages)、树突状细胞(dcnd rjtic ce】ls，Dc)的基序在寄生虫学』=的应用还不是很多，但
也不乏成细胞内活性氧(reactive ox yg en specics，R Os)[蚓含功的例子。量增加，激发了细胞内、的应激激酶途径(stress k-一剩什曼原虫(上七z5^mH”缸m州矿)能耐受BALB ／n a s c p“hw8y)[“J。细胞通过一系列的生化反应最终c小鼠产生的TH2型免疫反应，并可致死。
Pa L rI cia激活了转录因子激活蛋白一1(transcription factor 等¨”，用包含cpG基序的0DN和利什曼原
虫冻融
act【va ti“g p ro te in1，AP一1)。AP—l通过对核转录因苗(freeze／thawte d F／T)免疫易感BA LB／c小鼠，子NFkB(nu clear faclor—kappa B)的抑制因子1一k B诱导了利什曼原虫特异性的主要是THl型的免疫(inhibitor ka pp a B)的磷酸化而使I—kB易降解，从反应，并在用利仆曼原虫攻击时诱导了40％的保护而促进NFkB进入细胞核，增强细胞因子基因的转率，对照组则无保护率(F仃PBs、F／T对照ODN、录和抗体的分泌2 。F／T均为o％)。进一步研究表明，当小鼠先感染到经c p G ODN作用的巨噬细胞、树突状细胞等利什曼原虫后，然后用(’pG oDN在感染点和远离抗原提呈细胞(antige“presenting cclls，APc)中，感染点的部位，产生了6j～95％的保护率。随万方数据
一—一～———～——～———一——一～—一——一——～———一——一～———
d 4
中国兽医
寄生虫病 2 0()1年7月
后进行的机制研究表明，I F N 7基因敲除(k n oc k 等”““。的研究在曼氏血吸虫基斟组中存在c p G 回
ou t ，K 0)B AL B ／c 小鼠，无论c p G OD N 还是对照 避和T pG 、C pA 过剩的现象，这和甲基化基冈组的
ODN 、PBs 均不能提供保护作用(保护率为o ％、 特点相类似。这是否和血吸虫在宿主体内引发的免 o ％、O ％)；用抗lL 1 2单克隆抗体也完全中和了 疫状态有关，还有待于进一步研究。 BA 】。B ／c 小鼠的cpG ODN 产生的保护效果。作者
许多寄生虫(例如吸虫)的个体较大，结构、抗原
认为．c p G()D N 基序通过依赖I L —12和I FN 一丫的 成分比较复杂，并且在其整个生活史过程中往往会 机制产生r 拿身性免疫保护作用，并且可作为疫苗 经历几个阶段、寄生于几个宿主，引起宿主的免疫反 佐剂和潜在的免疫药物和预防利什曼原虫
应、病理过程也很复杂。怎样调动宿主的免疫保护机 病。zimmerman 等“5‘报道，给感染利什曼原虫20天 制、调节宿主的各种免疫效应机制是寄生虫病免疫 后的BA LB ／c 小鼠注射人：[合成c pG O DN ，仍有 防治的重要方面。C pG ()DN 作为一种有效的引发 作用，他们推测，c pG ODN 改变了机体已经存 强烈THl 璀细胞毒T 淋巴细胞反应的佐剂可以诱 在的TH2反应。
导抗原特异性的获得性免疫保护力，并引发体漓和
Chiaranlonte 等o“报道，在用曼氏血吸虫虫卵 细胞介导的免疫反应，甚至能扭转体内业已存在的 诱导的鼠肺肉芽肿模型的研究中，c p G oDN 减轻 TH2型免疫反应，我们千H 信cp(；ODN 作为疫苗佐
了小鼠的病理反应：出卵肉芽肿变小、肉芽肿嗜酸性 剂或免疫增强剂在寄生虫病防治中有一定的应用潜 细胞浸润减少、T H 2型细胞因子表达被抑制、促进 力。
19G2b 抗体的分泌，抑制TgG 】抗体的分泌。在细胞
(致谢：本文承蒙蔡幼民研究员和林矫矫研究员
因子基因敲除小鼠在研究T H2型反应调节机制时 审阅)。 发现，CpG()DN 的功能是和H 。一12完全无关的，并
参考文献：
且在II ，12基因敲除的小鼠中，用虫卵和cp(：oDN 致敏后，观察到T H 2型细胞因子和肉芽肿炎性反应 L1]陆军，严维耀，郑兆鑫．cpG 序列的免疫激活机理及应用
[J]．http ：／／www bi()en z 【n c ．c om ．2000
被显著抑制，而且这种变化不依赖于N K 细胞、B 细 L2 Krlo g AM ．Y l AK ，K11nm all DM ．c p (j motlfs m b ac te
胞。更多的研究表明，cpG ODN 的刺激在野生型和 rJal DNA
t r lg ge r dlrect
B cell acflvaLi cm[J]．Nat urc ， IL —12基因敲除小鼠中均引起1L 一10、B7．1和CD40 1鲫S ，4：374(6522)：546
山东省警官培训学院
459．
的七升。在II 。一12基冈敲除小鼠中巨噬细胞、树突状 3]Yl A K ，H o r n b e c k P ．Kr I eg AM ．(：p G D N A of
m u T l n e B 1ymp ho ma celk {To nl anll 一IgM indu ced
细胞分泌的IL —lo 显著增加，并且IL 10抑制虫卵 g r o w t h a r r c s t alm p r o g r n m m e d Jl dea th assoc la te d
特异性的’rH2型反应。和II ．一12基斟敲除小鼠对
wlt}l i Ⅱc r e as e d e x pr e ss i on of my ㈨d bcJ xL[门．J
照，Il 。12、1L]O 基因敲除小鼠中IFN 一7分泌细胞
1mmIn01．【996，i 57(11)：4918 4925 的显著增加解释TH2型反应的减弱是和1L 12无 。d]ch¨c IH ，H∞hc N A ，c (1w d e r v Js
Ba cte nal D N A
1ndu ced N K cell I F N g a m m a pr od uc ti (m dcperldent 关，而是由于B7．1和cD40蛋白表达的增加，lL 4／
macroph “ge of II ，一12[Jj ．c11n I m m u n o l I m
I L 5分泌细胞的显著减少也增强了IF N ～7的反应，
mun(】pathol ，1997．84(2)：185—1％． 这样，一条特
异的和lL 1 2无关的THl 型反应激活
[5]Halpcrn
侠盗石川MD ．Kurla nder RJ ，P1s etskv D s B a c te r l al 途径被揭示了。他们认为，一方面IL —12、I L ，l o 都能
1)N A 1nd uc es In ur ine I nte rk r()n —g aIn ma pr (】du cu on bv stlmuhti 【)n of 】Ilterleukin 12 a n d t u H l (J r nec n )s i s f a ct n r —
调节c p G ()D N 诱导的T H l 刊反应；另方面c p G alpha¨]．cc¨Imnmnol，1096，167(1)：72—78．
ODN 诱导的TH2
型反应抑制机制包括了和IL 1 2
[6]Yanlam()to S ，Yam afn()to T ，T o k u n a g a T ．n N A f r o m
无关的11，10的改变以及共刺激分子(c()stl mul ato b ac t e r i a ，b u t n o t fr( ertcbr“es，Induces
i n te r nr o ns ，
ry mo{ecule)的表达，cpG O DN 作为疫苗的佐剂可
a c t l v a t c s nat ura l k11lcr cells an d ln hl h jt s tum or gr owtll 以预防TH2型相关的免疫病理。张耀壁等””用Puc
一．1]．Mlc rf)hlol Immun 01，1992，36(9)：983
997．
L7J K lIIi man DM ，Y i A K ．K r l 89
AM C p G m 。t l k p r e s e n t 19质粒作为c p G 基序的来源，利用日本血吸虫
bacter ia D N A r ap id l y l nd u ce l y mp h 。c yt es L 。s e cr e 吣
62KD 肌球蛋白片段，fIr V 一5，构建的DNA 疫苗
Interleuk ln 6，|nt erleukn 】2，a 11d interf cron ganlma
VR s j 62共同免疫c 581／6小鼠．未能增强特异性抗 [IJ ．Proc N a t I A c a d sd ，1996，93(7)：2879 2883． L 8j YaⅡlam oto s ， y ¨m a m o t o T ， T 。ku n “98 T ． Unlqu e
体反应(和D NA 疫苗组丰H 比)，也未观察到对日本
pallndr(Ⅲ1ic s c ({l l e n c e s m s v nt he t ic ()1190nu c le ot l dc s
血吸虫尾蚴感染的抵抗作用。血吸虫属于扁形动物 r2qmr ed to lnd u ce
1FN(correc tu)n of INF)and
门，其基因组中电存在c p G 抑制现象。根据M u s t o me nt IF N —me d 】a te [1(co rr ec tt o n of I N F )n a t u r a I k11l er
万方数据
第9卷第3期傅志强等：cpG基序的作用机埋及其奈寄生虫学上的应用
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F U Z¨qid“g，LIU JiI】．millg
(S^dng^d2』725t z￡“抬。r D㈣，}f(AⅢf以P洲s：ooz。m’，∞A片
Abstract：，rhe unmethylated C pG motifs are。1igodeoxynl】d∞tides that h av e stro“g immtlnostlmu一万方数据
中国兽医寄生虫病
laL。‘y activity．1n thls a pp e r，w e r e v ic w e d the background of study i“g and the mecha nlsm of a ct i o n ab。u t CpG Hlotifs an d i nt r od uc e d its ap p li c at i。n in p“asitojogy尊s well．
Key w o r d s：Cp G；im m un。一s t I mu la t i“g；m e ch an l sn“p ar a si t。lo g y
·防治知识·
新孢予虫病(Neosp0H，sis)从发现至今时Ⅻ不长。但现细胞等传代细胞系中生长发育(蒋金书，2。。o)。已确证，
它是世界上许多地区母牛发生流产、产死胎的最主2流行病学澳大利亚、新西兰、比利时、丹麦、法国、德国、要原冈。据报道，该病每年给澳大利亚肉牛、奶牛业造成的损芬兰、西班牙、匈牙利、瑞士、瑞典、挪威、荷兰、英国、爱尔兰、失达l亿多美元。并且，谈病电流行于其它多种动物rp，特美国、加拿大、墨西哥、哥斯选里加、日本、以列、南非、津巴别是犬，使感染孕畜发生流产或产死胎，新生胎儿发生神经却韦等世界绝大部分地区已发现了新孢于虫病的流行。新孢系统疾病、运动障碍。其发病机理、生活史尚不清楚。由于我子虫可感染犬、奶牛、肉牛、水牛、绵羊、羊、马、鹿、猪、猴、国每年从欧美等国引进大量种牛，很有可髓同时引进带有本骆驼、狐狸、小鼠、大鼠、猫和兔。它的寄生部位是叶『枢神经系病的牛只。因此，准确渗断和有效防制本病具有特别重要的统、肌肉、肝、脑及其它内脏组织。A nderson等(199；)发现加意义。州42．5％的流产母牛是由新孢子虫感染所引起的，该州的1病原新孢于虫病是由犬新孢子虫(Ⅳ棚s声。似∞ni“m某些奶牛场中犊牛先天性感染者竟高选78％～88％。在北nlh。ytl 988)感染所引起。犬新孢子虫最早分离于1988年。美2000年奶牛犬新饱子虫『f『【清阳性率达2d％。母牛流产主属顶复门、孢子虫纲、球虫哑纲、真球虫目。要发生在妊娠3～9月龄，特别足在5～7月龄。在美国、英国
瓤孢子虫为细胞内寄生原虫．形态与龚地弓形虫(10zD-部分地区犬的犬新孢，虫的血清阳性率达16．6％。尚不能声￡㈣舻ndzz)相似。龚地弓形虫和新孢子虫的16s样的排除新孢子虫不能感染人。由于我国每年从欧美等国引进大
fRNA基网序列相同，但新孢子虫没有龚地弓形虫的3种主量奶牛，很有可能同时引进带有本病的牛只，故不能排除我要同源基因B1、P22和P30，新抱子虫抗『『『L清和龚地弓形虫、国不存在本病。本病一年四季均可发生。引起的流产呈散发枯氏住肉抱子虫、艾美耳球虫、隐抱子虫等只有较低的或无性或地方性流行，同一母畜可能反复发生流产。本病可经胎交叉反应。用随机扩增多态性DNA(RAPD)研究表明，新抱盘发生垂直传播给子代。，犬为终末宿主，aI引起水平传播，子虫的基因与弓形虫、住肉孢于虫的不同(蒋金书，2000)。3致病机理本病的发病机理尚不清楚。牛病毒性腹泻病新饱子虫在其全部生活史中叫出现数种不同的形态，即毒感染在牛的掰孢r虫感染致病过程中起到协同的作用。
通速殖子、组织包囊、卵囊、裂殖体、裂殖子等。过病例对照研究，BJofkn，an等(2。oo)认为，牛感染牛病毒性1．1速殖子呈卵圆形、圆形或新月形，大小平均为5“m×腹玛病毒后，其它病原较易通过母体和胎儿问胎盘屏障。
2弘m。用透射电镜观察，逮殖r体表有3层结构的单位膜，224免疫机理在通过使用单克隆抗体清除BALB／c小鼠相根膜下微管，1个极环，1个锥体，1个高尔基体，1个泡状核应的淋巴细胞，Tanaka等(2000)发现在机体抵抗新孢子虫和1个核仁，8～18根电子致密的棒状体(龚地弓形虫棒状感染中，(：D4+T淋巴细胞比cJ]8+T淋巴细胞更重要。
抗体旱蜂窝状)，多个线粒体和内质网，有微线。大多数速殖子原提呈纲胎，如巨噬细胞等获得抗原信息，将T细胞激活。寄牛于细胞内带虫空泡中(蒋盎朽．2000)。cDd十T淋巴细胞中的Thl细胞分泌IL一2、7 IFN，激
活巨
1 2包囊或称组织包囊呈圆形或卵圆形，大小不等，一般嗡细胞等，乐死细胞内的虫体。故丫一IFN在剞L体抵抗新孢子
为15～35pnl×1 0～27卢m，最长者可达107弘m。包囊壁平滑．虫早期感染中起一定的作用。cD4+T淋巴细胞rrl的Th2
细厚1～3pnl，旱分支的管状结构，无间隔膜。包囊中含有大量+ 胞分泌IL 5、lL 6、II．10等，调节机体抗新孢子虫抗体的产
的、细长形的缓殖于，大小为3．4～1．3岬×o．9～1．3pm。鹱生，抵抗瓤孢子虫感染，抑制其繁殖。给小鼠注射细胞培养的殖子内的纲胞器与速殖子相似，但其棒状体的数目少，含犬新孢子虫速殖子裂解物十佐荆，100蹦阻止了通过胎盘的PAS阳性颗粒多，细胞核靠一端。包囊壁用过碘酸雪夫氏垂直传播的发生。机体可通过抗体依戆性细胞毒性作用、调(PAS)染，常晕嗜银染。缓殖子之间
枣阳市委书记常有管泡状结构(蒋理素作用等消灭新孢予虫虫体；这同龚地弓形虫的保护性免金书，20。o)。疫机制有所不同。一般来说，抗细胞内寄生原虫感染的保护1．3 卵囊发现于犬的粪便中，其直径为11．7Ⅳm×11．性机理大多数是免疫细胞免疫。新孢子虫为细胞内寄生原3pm。卵囊的孢子化时间为24小时。孢子化卵囊内含2个孢虫。机体抵抗新孢子虫感染保护忭免疫机理，包括cD4斗淋于囊，无斯氏休．每个孢子囊内含4个子孢子，1个孢子囊残巴细胞的作用有待于进一步研究。体。子孢子无折光体(蒋会书，200(】)。查红波(中国农业大学动物医学院，北京100094；
新孢子虫的休外培养已经成功，常用牛单核细胞苄¨牛心E ma玑zhah ongb o 92@29l l net)
肺动脉上皮细胞进行培养。新孢子虫也可在牛肾细胞、vero(收稿日期：20。1 02 05)万方数据
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