彭康琳1，周玉庆2，周正适3，
（中南大学1.湘雅二医院心胸外科；2.湘雅三医院心内科；3.教养的芬芳湘雅医学院实验动物学部，长沙410000)
【摘要】目的 建立一种滴注剂量精确的大鼠无创气管滴注方法。方法 选用一次性使用静脉输液针的胶管制作套管，透射光插管法行大鼠气管插管，微量进样器平头针经由套管插入气管进行滴注。滴注液体为生理盐水，滴注剂量5~200μL,精确度为1μL。结果 在体重200~350g的10只大鼠上共完成50次气管滴注操作，实验过程中和实验之后大鼠均无异常表现。结论 套管微量进样器法具有无创、精确、安全的特点，可广泛应用于大鼠经气管给药或染毒的各类研究。 【关键词】大鼠；气管滴注；方法
A high accuracy method for non-invasive intratracheal instillation in rats
PENG Kang-lin1,ZHOU Yu-qing2, ZHOU Zheng-shi3
(1.Department of Cardiothoracic surgery,Second Xiangya Hospital;2.Department of Cardiology,Third Xiangya Hospital;3.Department of Laboratory Animal,Xiangya School of Medicine,Central South University,Changsha 410000,China)
【Abstract】Objective To develop a high accuracy method for non-invasive intratracheal instillation in rats. Methods The plastic catheter of disposable venous infusion needle was cut into a cannula,which was then intubated by transillumination.A microsyringe was introduced into the rat trachea through the cannula before the intratracheal instillation of saline solution was performed.The instilled volume ranged from 5μL to 200μL and the accuracy is 1μL. Results The intratracheal instillation operation was performed successfully for 50 times in 10 rats weighing 200~350g.The general health status was not affected during or after the operation in the rats.Conclusion The method developed in our study for intratracheal instillation is characterized by non-invasion, accuracy and safety,which could be widely used in intratracheal drug administration or poisoning in rats.
【key words】 Rat;Intratracheal instillation;Method
[作者简介]彭康琳（1985-），女，护师，本科，毕业于中南大学湘雅医学院护理系。
[通信作者]周正适。E-mail：zs.zhou@163
气管滴注是大鼠经气管给药或染毒的主要实验方法，其滴注剂量通常只有几十到几百微升，这种以微升计的精确性，普通注射器是无法达到的，只有微量进样器才符合要求。在有创的气管滴注[1]中，实验者可以切开大鼠颈部的皮肤和肌肉以暴露气管，再将尖头的微量进样器直接插入气管，从而做到精确滴注，但在无创的气管滴注中，实验者却不能使用微量进样器直接插入气管进行滴注，这是因为：无论平头或尖头的微量进样器相对于大鼠的口腔、咽喉和气管组织来说都过细过硬，容易损伤实验动物；微量进样器缺乏明确的气管插入标志；滴注完成之后无法通过微量进样器向气管内注入空气。
实际上，在无创的气管滴注中，国内外实验者通常都采用磨钝的静脉留置针或穿刺针进行气管插管，这些插管针的接口都是和普通注射器相匹配的，因此，实验者只能选择普通注射器进行滴注[1-5]，这种使用普通注射器进行无创气管滴注的精确性远远不如使用微量进
样器的有创气管滴注。
简言之，现行的大鼠气管滴注方法尚不能同时兼顾精确性和无创性，而这两点都是实验者所希望达到的，因此，我们在科研实践中设计出一种滴注剂量精确而且是无创的大鼠气管滴注方法，该方法最大的特点就是套管和微量进样器的使用。现将该套管微量进样器法的具体操作和注意事项介绍如下。
1．材料与方法
1.1 材料
1.1.1套管的制作：选用一次性使用静脉输液针，将胶管修剪成一端保留注射器接口、另一端呈斜面的套管，长度以微量进样器的平头针完全插入套管时末端露出1~2mm为宜。
1.1.2 钢芯的制作：套管过软无法直接插管，选用直径1.2mm的不锈钢丝制作成钢芯；钢芯末端经过烧熔和打磨呈圆滑状；钢芯并非笔直，而是稍加弯曲呈轻微的起伏，以插入套管后能与套管内壁接触产生一定的摩擦力为宜；将套管套在钢芯上，使得钢芯末端位于套管斜面处，待用。
1.1.3 实验动物：SPF级雄性SD大鼠10只，体重200~350g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号【SCXK(湘)2011-0003】，饲养于中南大学湘雅医学院实验动物学部，实验动物使用许可证号【SYXK(湘)2011-0001】。
1.1.4 滴注液体：生理盐水，每只大鼠连续5天进行5次气管滴注，滴注剂量在5~200μL范围内随机选择。
1.1.5 微量进样器：上海安亭，最大容量50μL，最小刻度1μL，平头针。
1.2 方法
1.2.1 麻醉与固定：1%钠按30mg/kg体重腹腔注射；使麻醉大鼠呈仰卧位，四肢和上切牙分别用橡皮筋和尼龙绳固定在大鼠手术台上，头部朝向实验者，在大鼠后颈部垫一小块纱布以抬高气管口位置。
1.2.2 套管的气管插管：透射光插管法[6-10]进行套管的气管插管，透射光源为台灯或手电筒，由实验者的助手将光源对准大鼠前颈部；实验者将大鼠的舌体向一侧牵出，同时用压舌板将舌根向上提压，在透射光照明下，可见忽明忽暗的气管口，将内置钢芯的套管插入
气管口，尽量插深，保证套管的注射器接口露出口腔即可；松开牵出的舌体，轻轻将钢芯从套管中抽出，将棉花纤维放置于套管的注射器接口，若棉花纤维随着大鼠呼出的空气前后摆动，则表明插管成功，反之，则重新插管。
1.2.3 气管滴注：将微量进样器的平头针完全插入套管，将大鼠手术台竖起，轻推微量进样器将生理盐水注入气管，当滴注量超过微量进样器的最大容量（50μL）时，可将微量进样器抽出，抽吸生理盐水后再次插入套管进行滴注，反复操作直至全部生理盐水滴注完毕。
1.2.4 滴注后操作：滴注完毕后，轻轻将微量进样器的平头针从套管中抽出，用棉花纤维再次确认套管是否仍插在大鼠气管中。套管的注射器接口和空的2.5mL注射器相连接，快速将空气注入，以利溶液向大鼠气管深处扩散，立即拔出注射器，保持大鼠手术台继续竖起，十分钟后将大鼠从手术台上取下，使之呈仰卧位直至苏醒。苏醒过程中，为防止粘稠状唾液进入并堵塞气管，套管必须一直插在大鼠气管中，实验者需不时将棉花纤维置于套管口，观察棉花纤维是否摆动以确认套管是否仍插在大鼠气管中，若套管脱出则立即重新插管。大鼠苏醒后，任其自行咳出套管或由实验者拔出。
2．结果
共完成50次大鼠气管滴注操作，实验动物在历经的5次操作过程中均能保持较平稳呼吸，没有窒息或死亡，苏醒后身体状况、进食、饮水、活动等均无异常，说明该方法具有良好的安全性。
3．讨论
国内外采用大鼠气管滴注来进行的研究相当常见，但正如引言所述，现行的无创方法不允许直接使用微量进样器进行精确滴注，因此，我们在透射光气管插管法的基础上，设计出微量进样器经由套管插入气管再进行滴注的方法，该方法实质上是微量进样器的直接滴注，套管起到了防止微量进样器损伤组织、明确的气管插入标志和注入空气通道的作用。
3.1实验材料的设计
选用一次性使用静脉输液针的胶管来制作套管，该胶管与大鼠气管粗细相仿，且具有一定弹性，即使是体重350g的大鼠，插入后都能将其气管撑起，与气管壁紧密贴合。套管的长度以微量进样器的平头针完全插入套管时末端露出1~2mm为宜，目的是防止平头针露出部分过长损伤大鼠气管，同时保证滴注的液体直接滴注入气管，避免与套管壁接触而残留其上。
套管太过柔软，因此我们设计了钢芯来支撑套管插入大鼠气管，钢芯的末端设计成圆滑状，钢芯插入套管时末端位于套管斜面处，目的都是为了防止插管时损伤大鼠咽喉和气管。钢芯本身呈轻微的起伏，能与套管内壁接触产生一定的摩擦力，目的是防止套管在钢芯上的滑动：套管若向前滑动，则套管前端部分会弯曲阻挡套管和钢芯的插入；套管若向后滑动，则只是钢芯插入，而套管不能随钢芯插入。另外，钢芯没有弯曲得太过，是避免和套管接触太紧，插管之后不能顺利抽出。
本研究中，我们使用的是最大容量50μL，最小刻度1μL的微量进样器，由于微量进样器通常是最大容量越小，精确度越高，因此各位同行还可以根据自己的实验要求，选用最大容量马宗林25μL，10μL或更小的微量进样器，从而获得0.5μL，0.2μL甚至0.1μ华中理工大学学报L的精确度。
3.2 实验方法的设计
在预实验中，我们首先尝试了常规的无创气管滴注方法，即用静脉留置针气管插管，然后用普通注射器连接静脉留置针注入液体，发现该操作存在精确性和安全性的不足：普通注射器抽取和注射时都不如微量进样器精确；即使是1mL的注射器，最小刻度也有钋-21050μL，只能滴注50μL、100μL、150μL、200μL等剂量的液体，限制了实验者在设计滴注剂量时的自由；滴注时容易在注射器底部和注射器接口处残留液体，增大误差；滴注时，气管与外界隔绝，大鼠不能保持正常呼吸，若滴注时间较长，则容易发生呼吸紊乱、缺氧或窒息。
随后，我们尝试将微量进样器直接插入大鼠气管进行滴注，结果发现该操作无法完成，因为：保持冷静 继续前行细且硬的平头针容易损伤口腔和咽喉；利比亚 石油没有明确的观察指标来判断平头针是否插入气管；无法注入空气以利液体向气管深处扩散；操作引起口腔大量分泌粘稠状唾液，易堵塞气管引起呼吸紊乱、窒息和死亡；滴注量超过微量进样器最大容量时，需要拔出与重新插管，增加了操作的复杂性与损伤大鼠的几率。
经过反复实践，我们最终设计出微量进样器的平头针经由套管来进行滴注的方法，该方法实质上是微量进样器的直接滴注，最大优点是确保了滴注剂量的精确性并且能进行任意剂量的滴注，此外，该方法还具有以下优点：柔软的套管不容易损伤咽喉和气管；有明确的气管插入判断标志，通过棉花纤维的摆动来判断套管是否插入气管，确保滴注液体进入气管；套管内径比平头针外径要大，平头针插入套管时，大鼠仍能通过平头针与套管之间的空腔来保持正常呼吸，减少缺氧的发生；套管的注射器接口可以与普通的注射器相连接注入空气；由于套管与气管壁紧密贴合，口腔内的粘稠状唾液也很少进入气管，保证了呼吸道的通畅，大大降低了大鼠呼吸紊乱、窒息或死亡的发生，也避免了使用阿托品等抑制唾液分泌的药物对滴注药物效果或染毒效果的影响；微量进样器通过套管拔出和重新插入滴注都容易完成，使得该方法不仅适合于小剂量的精确滴注，而且同样适合于较大剂量的精确滴注。
综上所述，采用套管微量进样器法进行大鼠气管滴注，能同时满足无创性和精确性的要求，该方法在安全性上也有保证，可广泛应用于大鼠经气管给药或染毒的各类研究。
参考文献：
[1]徐淑云,卞如濂,陈修,等.药理实验方法学（第三版）[M].北京:人民卫生出版社，2006:1393-1394
[2] Bell RR,Nonavinakere VK,Soliman MR.Intratracheal exposure of the guinea pig lung to cadmium and/or selenium:a histological evaluation[J].Toxicol Lett,2000,114(1-3):101-109.
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