沈满意;马晓萍
国民党王牌军覆灭记【摘 要】目的 通过局部应用苯扎氯铵(benzalkonium chloride,BAC)建立大鼠干眼模型,观察羊膜凝胶对大鼠干眼的作用.方法 随机选取25只健康Wistar大鼠制作干眼动物模型后,随机分为干眼对照组(A组)、溶剂组(B组)、羊膜提取液组(C组)、羊膜凝胶组(D组)和人工泪液组(E组),另取5只大鼠作为正常对照组.每组前后分别检测大鼠干眼指标,包括泪液分泌试验、泪膜破裂时间及角膜荧光染评分.4周后收集大鼠眼组织标本行病理及生化检测,包括角膜HE染、PAS染、免疫组化染及TUNEL试验.结果 随着时间的延长,羊膜匀浆提取液及羊膜凝胶均可改善大鼠干眼状况.4周后D组大鼠的各项干眼指标相对于B组均有明显好转,干眼效果明显优于E组(P＜0.05).另外,羊膜凝胶可使干眼大鼠的角膜上皮平整规则,角膜上皮K10表达下调,增加角膜MUC1的表达,有助于维持泪膜稳定性.结论 羊膜凝胶可通过维持角膜上皮完整性,抑制角结膜鳞状上皮化生,促进结膜杯状细胞增殖、黏蛋白分泌而减轻干眼的病理损伤,从而缓解干眼的症状,具有大鼠干眼的效果. 【期刊名称】公共自行车服务系统《复旦学报（医学版）》
【年(卷),期】2019(046)002
【总页数】9页(P217-225)
【关键词】干眼;苯扎氯铵(BAC);羊膜;角蛋白10;黏蛋白1
【作 者】沈满意;马晓萍
【作者单位】复旦大学附属中山医院眼科 上海200032;复旦大学附属中山医院眼科 上海200032
疾病监测
【正文语种】中 文
【中图分类】公安海警R772.2
干眼是最常见的眼表疾病,随着电子设备的广泛应用、现代人生活方式的改变及环境因素的恶化,干眼的发病率逐年增高,并呈年轻化趋势。干眼患者常出现眼部干涩感、异物感、畏光、视物模糊等症状,轻者影响工作和生活质量,重者可导致角膜上皮细胞的鳞状化生,甚至引起角膜感染、角膜溃疡及瘢痕形成等,使视功能严重受损[1]。目前干眼的以人工泪液
滴眼为主,可在一定程度上缓解患者眼部不适症状,但对中、重度干眼的效果不佳。
羊膜从细胞滋养层衍化而来,位于胎膜的最内层,由母体外绒毛膜和胎儿内羊膜组成。Gregory[2]将羊膜移植应用到重度干眼患者(Stevens-Johnson综合征)的眼表,取得了良好的疗效。近年来,大量研究发现由羊膜中的可溶性成分制成羊膜提取液,同样能保留羊膜的生物学活性[3-4]。羊膜提取液可诱导上皮细胞增殖,IL-1b表达下调,并抑制炎症细胞浸润,在促进上皮细胞形成、抗炎和抑制角膜新生血管形成方面具有与羊膜移植相当的效果。羊膜提取液的滴眼给药常常会通过泪液冲洗或鼻泪管排出,眼部生物利用度差,且由于夜间给药不便,药理学峰谷现象突出,极大地影响了效果[5]。通过延长药物在眼内的停留时间或改善药物向角膜和结膜的渗透,可提高其眼部的生物利用率[6-7]。凝胶呈透明黏稠状,点眼后一般不引起视物模糊,与滴眼液相比,眼用凝胶具有延长角膜接触时间、减少给药频率、提高患者依从性等优点[8]。
本研究在制作羊膜匀浆提取液的基础上制成羊膜凝胶。通过0.2%苯扎氯铵(benzalkonum chloride,BAC)点眼制作大鼠干眼模型,检测各时间点干眼临床指标,初步探讨局部应用羊膜凝胶对减缓大鼠干眼模型眼表损害的作用,并通过组织病理学检查探讨其作用机制,以期为干眼的提供实验依据。
资料和方法
羊膜凝胶的制备 选取自剖宫产或顺产无菌接生的新鲜胎盘,产前血清学检查排除乙肝、丙肝、梅毒及风疹病毒、获得性免疫缺陷综合征等疾病,取材均在无菌操作下完成。将胎盘羊膜面用无菌生理盐水先冲去血块,并于抗生素生理盐水(2.5 μg/mL两性霉素B和1∶1 000妥布霉素)中漂洗40 min;随后将胎盘自羊膜与绒毛膜间的潜在空隙行钝性剥离,羊膜上皮面朝上置于无菌方盘中,并在无菌方盘中刮除羊膜的海绵层,用无菌生理盐水清洗。研磨羊膜,按1∶5(W/V)加入PBS,匀浆,将匀浆液置于4 ℃放置5天。5 000 r/min(r=10 cm)离心30 min,取上清液,调节pH至7.2,用0.22 μm滤膜过滤,取滤液为羊膜匀浆提取液,置于4 ℃冰箱保存备用。随后在制备羊膜匀浆提取液的基础上进行羊膜凝胶的制备。称取1 g卡波姆干粉,置于刻度50 mL的干烧杯内,加入25 mL羊膜匀浆液,边加边搅拌,使卡波姆充分吸水溶胀,水浴加热40 min;滴加碱液(NaOH溶液)调节pH至7.2,制备凝胶成功,补充羊膜匀浆液至总体积为50 mL,充分搅拌后得到羊膜凝胶。
建立干眼动物模型 选取30只健康的7周龄Wistar 雌性大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司),置于标准无菌环境,食物及水供给充足,饲养环境符合医学实验动物环境的要求。试验前
对所有大鼠进行裂隙灯下双眼眼表及眼前节检查,结果均正常。随机选取25只大鼠制作干眼动物模型,用0.2%BAC溶液滴双眼,3次/日,持续10天。干眼动物模型制作完成后,将小鼠随机分为干眼对照组(A组)、溶剂组(B组,PBS溶液)、羊膜提取液组(C组)、羊膜凝胶组(D组)和人工泪液组(E组,羧甲基纤维素钠滴眼液),每组5只,其余5只大鼠作为正常对照组(F组)。
实验步骤 B、C、D、E组大鼠分别使用PBS溶液、羊膜匀浆提取液、羊膜凝胶和人工泪液连续滴眼1个月,3次/日,而A、F大鼠不进行。于前及后1、2、3、4周分别对各组大鼠进行泪液分泌试验(schimers I test,SIT)、泪膜破裂时间(tear break-up time,BUT)试验和角膜荧光染评分。4周后对各组大鼠行过量麻醉处死,并进行角膜HE染、结膜PAS染、免疫组化实验及TUNEL试验。
泪液分泌试验 按0.3 mL/100 g于腹腔内注射10%水合氯醛溶液进行全身麻醉。轻拉大鼠下睑,将棉线一端置于下睑结膜中外1/3处,放置20 s后取出。用毫米刻度尺测量酚红棉线湿润变红部分的长度,每眼测量2次(间隔10 min),取平均值记录为SIT。
泪膜破裂时间 将2%荧光素钠溶液滴于大鼠结膜囊内,待荧光素钠溶液充分扩散后,于钴蓝光
下观察大鼠从睑裂打开至泪膜第1个破裂点出现的时长为泪膜裂时间结果。每眼观察3次,取平均值记录为BUT。
平衡电桥角膜荧光染 将2%荧光素钠溶液滴于大鼠结膜囊内,待荧光素钠溶液充分扩散后,将裂隙灯调至钴蓝光模式,观察角膜荧光素着染情况,判断角膜上皮缺损程度。将角膜平均分为鼻上、鼻下、颞上、颞下4个象限分别进行评分,各象限分值相加即为角膜的荧光素染评分。评分标准:0分,无着;1分,点状着≤30个;2分,点状着>30个,但不弥散;3分,严重的弥散性着,但尚未形成斑块状;4分,有斑块状着。
病理检测 滴眼4周后,各组动物以过量麻醉法(10%水合氯醛)安乐处死,迅速取出包括上下睑在内的完整眼部组织。4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片进行HE染,观察角膜上皮缺损程度;PAS染对结膜组织中富含黏蛋白的杯状细胞进行染分析,间接反映MUC5AC含量;取角结膜组织切片行MUC1及K10组化分析;TUNEL试验观察角膜上皮细胞凋亡状况。
统计分析 实验数据用表示,采用SPSS 19.0进行统计学分析。采用Wilcoxon配对秩和检验比较大鼠造模前后及前后的泪液分泌量、BUT及角膜荧光染评分。Kruskal-Wallis(K-W)检验比较同一时间点6组大鼠的各项干眼参数,随后采用Mann-Whitney检验对6组的干眼
参数进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
干眼指标变化 前,A、B、C、D、E组即经BAC诱导的干眼模型组间的大鼠泪液分泌量及BUT未见明显差异,各组泪液分泌量及泪膜稳定性均明显低于正常对照组(P均<0.05);经过4周,羊膜凝胶可明显促进泪液分泌,延长BUT,提示羊膜凝胶可有效改善造模后大鼠泪液分泌量减少的情况,有效促进泪膜的稳定性(表1,图1、2)。通过角膜荧光染评分来评价大鼠角膜上皮的完整性:A、B组大鼠的角膜荧光染评分较高,角膜上皮缺损程度严重,而C、D及E组大鼠经过4周,角膜上皮荧光染评分明显下降,但与F组间仍有明显差距。尽管C、D组的角膜荧光染评分与E组相比差异无统计学意义,但是从第3周开始C、D组的角膜荧光染评分低于E组(表1,图3),提示羊膜匀浆提取液和羊膜凝胶均可在一定程度上减少干眼大鼠的角膜上皮着染程度,提高角膜上皮的完整性。于裂隙灯下观察角膜上皮染状况(图4),同样可观察到A、B组大鼠角膜上皮呈大片着染,而C、D组大鼠角膜上皮仅见少量点状着染,与F组较为接近,提示羊膜匀浆提取液及羊膜凝胶能有效缓解角膜上皮缺损。
HE染 光镜下观察角膜组织变化(×200),A、B组大鼠角膜上皮细胞分层模糊,角膜上皮欠光
滑且变薄(2～4层),最薄处仅1～2层细胞,上皮表面轻度不规则;C、D组大鼠角膜上皮较为光滑,细胞排列较为规则(4～5层);E组大鼠角膜上皮细胞与A、B组相比排列整齐,而分层较C、D组少;F组为正常小鼠,上皮分层良好(5～6层),细胞排列紧密整齐,形态较为完整(图5)。
表1 大鼠分组前后的干眼指标观察Tab1 Change of dry eye index before and after treatment in all groups of ratsDry eye indexGroup AGroup BGroup CGroup DGroup EGroup FSIT (mm) Before treatment4.60±0.704.80±0.794.60±0.704.70±0.824.70±0.789.00±0.82 After treatment(1)4.70±1.065.20±1.038.60±0.708.80±1.237.70±1.069.10±0.74 P0.820.500.000.000.000.99BUT (s) Before treatment1.75±0.541.65±0.341.70±0.621.65±0.341.60±0.393.85±0.75 After treatment(1)1.90±0.571.95±0.553.65±0.584.20±0.543.39±0.794.10±0.46 P0.560.330.000.000.000.34FL Before treatment11.90±1.3711.50±0.8611.80±1.1612.0±1.0511.50±0.758.00±0.94 After treatment(1)10.80±0.6711.00±0.828.60±0.528.90±0.819.20±0.758.90±1.21 P0.130.21<0.01<0.01<0.010.07
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