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谭 珊，宋欣媛，张明通，吴培福
（西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224）印库网
摘 要：为研究云南省昆明市动物园动物体内大肠杆菌（E.coli）分离株毒力基因的分布特征，从圆通山动物园37个动物种粪便中分离出37株E.coli，采用生化鉴定方法鉴定大肠杆菌，PCR方法检测19种毒力基因。鉴定结果表明：37株E.coli中，ompA、iroN、fimC、aatA、vat 5种毒力基因携带率分别为100%、95.49%、83.78%、70.27%、51.35%，ibeA、neuC、iutA、traT、stx 5种毒力基因携带率为0，其他9种毒力基因携带率均低于40.00%；分离菌株普遍携带8种以下毒力基因，同时携带10种以上毒力基因的概率为8.10%；分离株强毒力岛基因携带率较高，分布较为普遍。结果表明，昆明市圆通山动物园内流行的大肠杆菌以致病性大肠杆菌为主，不同种类动物体内大肠杆菌的毒力基因携带率存在较大差异，其原因可能与动物的饲养环境以及动物自身的适应能力和抵抗力有关。因此，对于动物园内具有 较高大肠杆菌致病风险的动物，要采取相应防治措施，防止大肠杆菌病发生与流行。
关键词：大肠杆菌；动物园；野生动物；毒力基因；分布特征
中图分类号：S852.61 文献标识码：A 文章编号：1005-944X（2019）04-0086-06
DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2019.04.020
Distribution of Virulence Genes of Escherichia coli
Isolated from the Zoo in Kunming City of Yunnan Province
Tan Shan，Song Xinyuan，Zhang Mingtong，Wu Peifu
（School of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650024，China）
Abstract：In order to study the distribution features of virulence genes of Escherichia coli（E.coli）in animals in the zoo in Kunming City of Yunnan province，37 strains li were isolated from the feces of 37 animal populations in Yuantongshan Zoo to li by biochemical identification and to detect 19 kinds of virulence genes by PCR. The results showed that，for 37 strains li，
the carrying rate of ompA，iroN，fimC，aatA and vat was 100%，95.49%，83.78%，70.27% and 51.35% respectively，that of ibeA，neuC，iutA，traT and stx was 0，that of other 9 kinds of virulence genes was lower than 40.00%. The isolates generally carried less than 8 kinds of virulence genes，the probability of carrying more than 10 kinds of virulence genes was 8.10%. Among which，the high pathogenicity island distributed widely with high carrying rate. The results indicated that li found in Yuantongshan Zoo in Kunming City were mainly pathogenic. The carrying rate of virulence genes li in different species of animals was quite different，which might be caused by the feeding environment，adaptability and immunity of animals themselves. Therefore，some measures should be taken to prevent and control the li.
Key words：E.coli；zoo；wild animal；virulence gene；distribution feature
收稿日期：2019-01-18 修回日期：2019-02-21通信作者：吴培福
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野生动物是一种宝贵的生物资源，在保持生物多样性与生态平衡中处于重要地位，对人类社会的持续发展有重要价值。动物园是饲养野生动物的重要场所，同样也流行一些动物疾病，其中大肠杆菌病较为普遍。致病性大肠杆菌能引起动物严重腹泻、蜂窝织炎、肿头综合征、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、脐带炎、眼炎、纤维蛋白性心包炎和败血症等[1]，给动物健康造成了严重影响。大肠杆菌的致病性由多种毒力因子共同决定。在大肠杆菌侵袭宿主组织并引起发病的过程中，这些毒力因子相互协调，共同发挥作用，帮助微生物逃避或破坏宿主防御机制，进而引发对宿主有害的炎症[2]
。因此，开展野生动物疾病防治研究，可以为保护野生动物和人类自身健康提供技术保障。本研究以昆明市圆通山动物园内37种不同动物源粪样中分离鉴定的大肠杆菌为研究对象，分析分离株毒力基因的流行病学特征，以期为动物园动物大肠杆菌病和防控提供参考。1 材料与方法1.1 样品采集
2018年3月，在圆通山动物园，随机无菌采集37种动物粪便样品各3份（表1）。1.2 培养基制备
麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、三糖铁培养基、LB 液体培养基等：均购于云南凌普生物科技有限公司，按常规方法配制。1.3 细菌分离
挑取0.1 g 粪样于2 mL 离心管中作105倍稀释，将得到的样品稀释液，运用平板划线法，通过伊红美蓝培养基（EMB ）、麦康凯培养基、LB 固体培养基培养观察，初步筛选大肠杆菌。1.4 细菌生化试验
根据《肠科细菌生化鉴定编码册》进行生化鉴定，包括糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、明胶液化试验、硫化氢试验等。
1.5 PCR 鉴定
根据GenBank 中大肠杆菌的ECO 和Uid 基因序列[3]，设计合成2对引物，序列见表2。
1.6 毒力基因扩增
根据GenBank 中已发表的大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrumβ-lactamases ，ESBLs ）毒力因子调查与分析
[4]
，将毒力引子
划分为：粘附素类基因（fimA 、fimH 、papA 、papC 、sfa 等），铁获得系统类基因（irp-2、fyuA 、iucA 、iucD 、iutA 、iroN
等），温度敏感
基因引物序列
扩增大小/bp
ECO
F ：5'-ATCAACCGAGATTCCCCCAGT-3'232
R ：5'-TCACTATCGGTCAGTCAGGAG-3'Uid F ：5'-GGCTTCTGTCAACGCTGTTT-3'293
R ：
5'-ACAGTTTTCGCGATCCAGAC-3'
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血凝素（tsh ），血清抗性蛋白（iss ），肠细胞脱落位点毒力岛（eaeA ），毒素（vat 、stx2f 、astA ），大肠杆菌素V （colv 、colBM ），溶血素（hlyE ），外膜蛋白（traT ），保护素（kpsmT-K 1、kpsmT II ），侵袭素（ibeA ）。采用Primer-Blast 设计引物并计算理论退火温度。引物由铂尚生
物技术（上海）有限公司合成，引物序列设计见表3。2 结果与分析
2.1 大肠杆菌分离与生化鉴定
从37种动物粪样中，共分离纯化出37株大肠杆菌。通过伊红美蓝培养基（EMB ）、麦康凯培养基、LB 固体培养基培养特性观察，在伊红美蓝培养基（EMB ）上，菌落中心呈深紫或无明显暗中心，菌落呈圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有绿金属光泽；在麦康凯培养基上，菌落为鲜桃红或微红，中心为深桃红，菌落呈圆形、扁平，边缘整齐，表面光滑、湿润；革兰染均为阴性。生化鉴定结果符合大肠杆菌特性（表4）。磁卡原理
注：⊕. 产酸、产气；+. 阳性；−. 阴性
2.2 PCR 检测
扩增的ECO 和Uid 目的条带大小分别为232 bp 和293 bp ，与预期目的片段大小一致（图5、图6），表明分离菌均为阳性。PCR 检测与生化鉴定结果相符，确定分离的病原菌为大肠杆菌。
表4 大肠杆菌生化鉴定结果
生化试验结果
生化试验结果葡萄糖⊕VP –乳糖⊕/–枸橼酸盐–麦芽糖⊕脲酶+甘露醇⊕三糖铁底层变黄有气
泡，不产H 2S
蔗糖⊕
明胶–吲哚+蛋白胨水+MR
+
硝酸盐
+
表3 毒力基因PCR 引物
毒力基因PCR 引物序列（5'—3'）
目标条带大小/bp 退火温
度/℃aatA
F ：CATAGGCGTTTCTCTTTCCGAT 1 226
51
R ：CCTGTCGTTCATACAGATTCGTT PapC F ：GCTGATATCACGCAGTCAGT 76850
R ：GTCAACAAGAAGACGTGTTCC tsh F ：GTCTGTCAGACGTCTGTGTTTC 59853
R ：ATAGGATGACAGGCTACCGAC fimC F ：GCCGATGGTGTAAAGGATGG 47550
R ：GGGTAAGTGCGCCATAATCA Vat F ：TCCATGCTTCAACGTCTCAGAG 93953
R ：CTGTTGTCAGTGTCGTGAACG ibeA F ：GTATGACGGTGGGAACAAGAG 32153
R ：TGGCAATAGCAGCGGCAGTC ompA F ：AGCTATCGCGATTGCAGTG 91950
R ：GGTGTTGCCAGTAACCGG neuc F ：GGTGGTACATTCCGGGATGTC 79251
R ：CATGGTGGTGAAAAGACATTAGC
cva/cvi F ：
TCCAAGCGGACCCCTTATAG 59850
R ：CGCAGCATAGTTCCATGCT iss
F ：ATCACATAGGATTCTGCC
G 30949
R ：CAGCGGAGTATAGATGCCA iron F ：CCTCCGACGATGATAATGACG 86649
R ：GATACCATTATGCGTAATGCC fyuA F ：ATGTGAAACTGCGTCTGGCG 72848
R ：CGCAGTAGGCACGATGTTGTA iucD F ：GAAGCATATGACACAATCCTG 61349
R ：CAGAGTGAAGTCATCACGCAC irp 2F ：CTGATGAACTCACTCGCTATCC 44053
R ：AGCATCTCCTGGCTCTGCTC chuA F ：GACGAACCAACGGTCAGGAT 27852
R ：TGCCGCCAGTACCAAAGACA iutA F ：GGCTGGACATCATGGGAACTGG 30256
R ：CGTCGGGAACGGGTAGAATCG traT
F ：GGTGTGGTGCGATGAGCACA
G 29056
R ：CACGGTTCAGCCATCCCTGAG stx F ：GAACGAAATAATTTATATGT 90040
R ：TTTGATTGTTACAGTCAT kspM F ：GCGCATTTGCTGATACTGTTG 27151
R ：CATCCAGACGATAAGCATGAGCA
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毒力基因毒力基因检出数/个
检出率/%ompA 37100iroN 3594.59fimC 3183.78aatA 2670.27vat 1951.35fyuA 1335.14iucD 924.32kspM 924.32iss 718.92irp 2
718.92tsh 616.22papC 410.81cva/cvi 410.81chuA 410.81ibeA 00neuC 00iutA 00traT 00stx
2.3 毒力基因分布
2.3.1 毒力基因检测 对分离鉴定出的37株大肠杆菌，利用19对毒力基因引物进行PCR 扩增。结果
显示：37株菌的ompA 基因检测全部为阳性，ibeA 、neuC 、iutA 、traT 、stx 检测全部为阴性；35株细菌（94.59%）检出iroN 阳性，31株（83.78%）检出fimC 阳性，26株（70.27%）检出aatA 阳性，19株（51.35%）检出vat 阳性，13株（35.14%）检出fyuA 阳性，6株（16.22%）检出tsh 阳性，其他基因的检测结果见表5。
2.3.2 同时携带毒力基因数量分布 运用PCR 方
47vcd法对37株大肠杆菌分离株的ompA 等19种毒力基因进行检测，并计算19种毒力基因的共携带率。结果显示：同时携带大于或等于10个毒力基因的
大肠杆菌有3株（8.10%），携带5~8个的有22株（59.46%），携带5个以下的有12株（32.43%），具体结果见表6。此次检测的19个毒力基因中，强毒力岛基因分别是tsh 、iroN 、fyuA 、iucD 、irp 2、traT 、iss 7种。在37个分离株中，同时携带6种强毒力岛基因的有3株，携带3~4种的有6株，携带2种的有9株，只携带1种的有18株，只有豪猪粪样中分离的1株菌株没有携带强毒力岛基因。强毒力岛基因中，iroN 的检出率最高，为94.59%，traT 未检出，其余的依次为fyuA （35.14%）、iucD （24.32%）、irp 2（18.92%）、iss （18.92%）、tsh （16.22%）。
2.3.3 毒力基因的动物种间分布 对37种动物粪
图5 ECO 基因片段电泳结果
图6 Uid
基因片段电泳结果
90
样分离提取的大肠杆菌携带毒力基因情况进行分析发现，棕树凤头鹦鹉中分离的大肠杆菌携带的毒力基因数最多（12个），其次是赤猴（11个）、马来熊（10个），最少的是老虎（2个），其余动物中大肠杆菌的携带情况见表7。
肉被骗走以后3 讨论
细菌毒力的强弱很大程度上取决于其所携带
的毒力因子（VFs ）[5]。目前，致病性大肠杆菌的毒力因子主要划分为黏附素（fim 、ompA ）、温度敏感血凝素（tsh 、iutA ）、摄铁系统（耶尔森强毒力岛基因irp 2、fyuA ）、侵袭因子（ibeA ）、血清抗性蛋白（iss ）、毒素和大肠杆菌素。
本研究对37株不同动物源粪样大肠杆菌分离株进行19种毒力基因检测，发现检出率相对较高的依次为ompA （100%）、iroN （94.59%）、fimC （83.78%）、aatA （70.27%）、vat （51.35%），其他的均在35.14%以下。由此可以看出，ompA 、iroN 、fimC 基因在圆通山动物园的致病性大肠杆菌中最为常见。fimC 、kspM 、papC 是菌毛蛋白基因，aatA 是转运蛋白，tsh 、iroN 、fyuA 、iucD 、irp 2、traT 、iss 7种基因属于强毒力岛基因[6]。7种强毒力岛基因中有6种在分离株中被检测出来，其中iroN 的携带率最高，为95.49%，其余5种的携带率也较高，说明动物园动物携带了不同致病性的大肠杆菌。
研究发现，动物大肠杆菌病的致病力与其携带的毒力因子种类及数量密切相关，涉及的基因主要有iutA 、tsh 、iroN 、cvaC 、astA 、iss 、irp 2、papC 、iucD 、vat 等。董向磊
[7]
研究认为，在
iutA 、iss 、tsh 、iroN 、irp2、cvaC 6种毒力基因中，如果APEC 分离株同时携带有2种以上毒力基因，则有89.74%的概率认定该分离株具有致病性，误差率为7.90%。
根据不同动物大肠杆菌毒力基因携带情况，结合相关研究推断，动物园动物中，棕树凤头鹦鹉、赤猴
、马来熊、麋鹿、绯胸鹦鹉、野猪等携带的毒力基因数量最多，由大肠杆菌致病的风险较高，豪猪、老虎、耳廓狐、环尾狐猴、灰叶猴、黑毛仙猴、黑叶猴等相对较低。导致这个结果的原因可能与它们的生活环境有关。生活环境较为密闭的动物，如老虎、耳廓狐、环尾狐猴、灰叶猴、黑毛仙猴、黑叶猴等动物体内的大肠杆菌携带的毒力基因种类较
少，而生活环境与外界接触较大的动物，如赤猴、
表6 同时携带毒力基因数量分布
携带毒力基因数/个菌株数/个
携带率/%携带毒力基因数/个菌株
数/个
携带率/%
21 2.707513.513513.51838.114616.22101 2.705616.22111 2.706
轴测图
8
21.62
浙江癌症村
12
1
2.70
表7 不同动物源大肠杆菌毒力因子携带情况
动物种类毒力基因数
动物种类毒力基因数
棕树凤头鹦鹉
12羊驼5赤猴11斑马5马来熊10绿孔雀5麋鹿8牡丹鹦鹉5绯胸鹦鹉8细尾獴5野猪8长臂猿猴5印度羚羊7袋鼠4大象7蓝白孔雀4狮子7山魈4棕熊7猩猩4狐猴7浣熊4骆驼6马4大角羊6耳廓狐3梅花鹿6环尾狐猴3犀牛6灰叶猴3长颈鹿6黑毛仙猴3蓝黄金刚鹦鹉
6黑叶猴3黑熊6老虎
2
豪猪
6
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