靛酚蓝法测定海水、河口水中铵氮的“盐效应”及其消除 黄晓
【摘 要】靛酚蓝法是国际上测定海水、河口水中铵氮(NH4-N)最常用的方法之一,但“盐效应”问题严重影响NH4-N测定的数据质量,需要将反应体系调整到最佳pH值,即:10.5.该文报道一种方法,依据样品盐度添加适量NaOH试剂来调节pH值到最佳,从而方便地解决靛酚蓝法测定咸水中NH4-N的“盐效应”问题,并通过真实样品的加标回收实验证明该方法的确有效.在光程为5cm时,该方法的检出限为0.03μmol/L,线性范围为0.2～8μmol/L,真实样品的加标回收率为96.9％～108.8％. 【期刊名称】《海峡科学》
【年(卷),期】2013(000)007
【总页数】4页(P3-6)
【关键词】铵氮;靛酚蓝法;盐效应;盐度校正;pH校正
【作 者】黄晓
【作者单位】厦门大学环境与生态学院我们这一班2
【正文语种】中 文
1 概述
铵氮(NH4-N)在海洋氮循环中扮演着十分重要的角。在海水养殖环境中，NH4-N很容易积累，是影响水产动物健康和导致死亡的重要原因[1, 2]。NH4-N还是海洋环境监测的必测项目[3]。测定海水中NH4-N的方法主要有荧光法[4]、靛酚蓝法[5, 6]和次溴酸盐法[3]。荧光法主要用于开阔大洋中nmol/L浓度水平NH4-N的测定，而靛酚蓝法和次溴酸盐法主要用于河口和近海NH4-N的测定。次溴酸盐法为间接方法，测定结果中含有部分氨基酸[7, 8]，因而只能定性或半定量地说明海洋环境状况的一个方面。靛酚蓝法则是测定NH4-N的特效方法，为科学界所认可并得到最广泛的应用。然而靛酚蓝法测定咸水中NH4-N却受到“盐效应”的显著影响[3, 6]，这使得在近海和河口水体中获取高质量的NH4-N数据并不容易[6]。研究表明，靛酚蓝法测定咸水中NH4-N显体系的最佳pH值为10.5[5, 6,9-11]，“盐效应”却
使反应体系的pH值随盐度发生漂移[5]。本研究旨在报道一种根据样品的盐度将反应体系调节至最佳pH值的方法，从而解决困扰靛酚蓝法测定咸水中NH4-N时的“盐效应”或者说pH值漂移问题。
2 靛酚蓝法的原理及其“盐效应”问题
2.1 靛酚蓝法原理
全国女排大奖赛在碱性条件下，以亚硝基铁(Na2[Fe(CN)5 NO]·2H2O)为催化剂，NH3与次氯酸盐(OCl-)和苯酚(C6H5OH)反应生成蓝的靛酚蓝。该反应的原理如式(1)～(3)所示[9]：
研究表明，pH影响NH2Cl的生成及其稳定性，NH2Cl在pH为10.5时有最大的稳定常数[9]。此外，靛酚蓝的形态也会随着pH的变化而变化，当碱性较强时，靛酚蓝以蓝的碱式结构为主；而当碱性较弱时，则形成黄的酸式结构(式4)。靛酚蓝法测定NH4-N的表观摩尔吸光系数随着pH的变化而变化，在pH为10.5左右有最大值[5, 6, 9-11]。因此，pH影响靛酚蓝反应的整个历程，且该反应测定NH4-N的最佳pH为10.5。
采油指数2.2 靛酚蓝法测定NH4-N的“盐效应”及其与pH的关系
靛酚蓝法在用于测定咸水中的NH4-N时，由于水样的Mg2+在碱性条件下会产生沉淀，导致试样混浊，因而给NH4-N测定带来麻烦，这就是应用靛酚蓝法测定NH4-N时最初遇到的“盐效应”。为了克服该问题，很多学者提出了不同的解决办法[12-15]，其中应用最广泛的是加入柠檬酸三钠(CIT3-)络合Mg2+来防止其沉淀[13]。该方法虽然解决了试样的沉淀问题，但仍然不能完全消除“盐效应”。表观上，在加入柠檬酸三钠络合Mg2+之后，靛酚蓝显的程度仍与样品的盐度大小有密切关系，因而有人提出根据盐度乘以一定的校正系数来消除盐度的影响[3, 16]。为区别起见，本文称后者为“剩余盐效应”。
靛酚蓝法的“剩余盐效应”并不是由离子强度造成的[11]，而是根源于体系的pH缓冲性能受到干扰[5, 17]。研究发现，海水中的Mg2+可与CIT3-反应生成Mg(CIT)-，进而与试样中的OH-发生络合反应[5]，即：
由于形成Mg(OH)(CIT)2-的反应消耗了OH-，因而反应体系的pH值发生不同程度的降低；又由于通常情况下淡水样品的Mg2+浓度远远低于海水，所以，当样品的盐度越大，Mg2+浓度就越高，式(5)所描述的化学缓冲体系对OH-的消耗也就越多，反应体系的pH值降低也就越显著。从硬度不大的普通淡水样品到典型的海水样品，体系的pH值可从10.5降阿旺传奇
低到9.8左右[5]。因此，靛酚蓝法“剩余盐效应”问题的实质是，反应体系的pH不足以使靛酚蓝充分保持在碱式状态(式(4))。
曾有人假设靛酚蓝法测定咸水中 NH4-N的表观摩尔吸光系数与pH呈二次函数关系，提出通过校正公式将pH≠10.5情况下测定的吸光值校正到pH=10.5情况下的吸光值，以此来消除“剩余盐效应”[18]。然而我们发现，此类校正公式并不符合式(1)～(4)所反映的平衡关系，而用所报道的pH校正公式得到的加标回收率也通常远高于100%，因此通过pH校正公式消除“剩余盐效应”的方案并不可靠。
综上所述，应用靛酚蓝法测定近海及河口水中铵氮，要想取得高质量数据的关键之一，就在于反应体系的 pH要控制在 10.5±0.1 [5, 6, 9, 11]。
3 实验设计
3.1 仪器与试剂
门外有敲门声
分光光度计；
聚乙烯材质的具塞刻度试管(本研究使用江苏康健医疗用品有限公司生产的KJ325型离心管)；
脱氨高纯水；
试剂R1——苯酚酒精溶液(100 g/L，以95%酒精为溶剂)；
试剂R2——柠檬酸三钠水溶液(400 g/L)；
试剂R3——碱性二氯异氰酸钠水溶液(10g/L二氯异氰酸钠+36 g/L NaOH，分别溶解之后再混合定容)；
试剂R4——氢氧化钠水溶液(44 g/L)；
试剂R5——亚硝基铁水溶液(5 g/L)；
旧金山和约 全文NH4-N标准储备液(水溶液10000μmol/L)；
精密pH计(可读数至0.1mV)和奥立龙8102BN Ross复合电极；
pH值为4.01、7.00和10.01的NBS标度pH缓冲液(Thermo Scientific公司生产)。
3.2 实验方法
3.2.1 工作曲线的配置
移取5 mL NH4-N标准储备液(10000 μmol/L)，用新制的脱氨高纯水定容至100 mL，配制成500 μmol/L的NH4-N标准使用液。分别移取0、0.1、1、2、4、6、8 mL标准使用液定容至100 mL，配成浓度为0、0.5、5、10、20、30、40mol/L的标准序列，参照3.2.2节的步骤显，测定吸光值(光程为1 cm比皿)。以浓度(μmol/L)为横坐标，吸光值为纵坐标，制作工作曲线。对于NH4-N浓度较低的海水样品，NH4-N工作曲线的浓度梯度为0、0.2、0.5、1、2、5 μmol/L，测定吸光值时换用光程为5 cm的比皿。
3.2.2 样品测定
定量移取25 mL样品，然后依次加入试剂R1、R2、R3各1mL，再按表1加入一定量的氢氧化钠试剂(R4)，最后加入1mL试剂R5。每次添加试剂都要充分混匀之后再加下一种试剂。加完试剂并混匀之后立即密封，置于25 ℃恒温水浴中反应2 h以上。在波长640 nm处测定
吸光值，代入工作曲线计算，再经过体积校正，消除不同体积氢氧化钠试剂R4的影响之后，即可得到样品的NH4-N浓度。
表1 消除“剩余盐效应”所需要的44 g/L氢氧化钠试剂(R4)的体积盐度<10 10～20>20 R4的添加量(μL)盐度×20盐度×25盐度×30
3.2.3 pH检验
鉴于靛酚蓝显体系的pH对铵氮测定的质量至关重要，样品测定完毕之后需要复核最终的pH。由于显反应是在25℃条件下进行，所以，样品及pH缓冲液均需恒温至25 ℃。
4 结果与讨论
4.1 工作曲线和空白
工作曲线和空白是控制数据质量的重要依据，空白对于极易受到污染的NH4-N样品尤为重要。为了保证数据质量，每批样品测定之前都必须检验工作曲线。正常情况下，多条工作曲线斜率的差别应在3%～5%以内。本实验室工作曲线斜率的相对标准偏差为2.55%，低
于3%～5%，详见表2。每次测样之前还应进行空白实验，以检测试剂和周围环境的污染情况。如果空白值偏高，则必须把空白值降低到正常值，且稳定之后方可测样。一般对于5 cm的比皿，典型空白值在0.090～0.110之间。本实验室采用5 cm比皿，以靛酚蓝法测定NH4-N的方法检出限为0.03 μmol/L，线性范围为0.2～8 μmol/L。较高浓度水样应改用1 cm的比皿，或者用无氨水适当稀释之后再测定。
表2 工作曲线的重现性仪器 参数 测定日期 工作曲线 斜率 平均值 标准偏差相对标准偏差(%)2011年5月30日 y=0.0875x-0.0067, R2=0.9990 0.0875 2011年6月4日 y=0.0871x-0.008, R2=0.9991 0.0871 2011年6月20日 y=0.0830x-0.0033, R2=0.9991 0.0830 722-分光光度计(5cm比皿)NH4-N 2011年8月10日 y = 0.0843x + 0.003, R2 = 0.9961 0.0843 0.0855 0.0022 2.55
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