网络出版时间：2222-11-232：31网络出版地址：https：//b oe/Pcms/Ve/W/34.1273.R.2222123.0921.026.ht/i
长链非编码RNA-RNU14在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义 刘芬1邹长蒳2，胡丹3，王晓宁1郑雄伟3，苏颖2，林贤东2
摘要：目的探讨EB病毒(Epsteiv-Barr virus,EBV)感染与胃癌的相关性及长链非编码RNA-RNU12表达与胃癌临床病理特征、EBV感染的关系，为EBV相关胃癌(Epstein-Barr virus-associateh yastrie carciooma,EBVaGC)的、控制和预防提供理论依据。方法收集胃腺癌患者12例，分析EBV感染与临床病理特征的关系。采用原位杂交技术检测胃癌组织标本EBV感染。应用qRT-PCR检测胃癌及癌旁组织中RNU12的表达水平及其与临床病理特征的关系。结果EBV感染与患者年龄、组织分化、Lauren分型及肿瘤大小有关(P<2.25)；与患者性别、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、脉管癌栓及神经侵犯无关(P >2.05)o RNU12在胃癌组织中的表达量为(2.01±2.024)，在癌旁组织中的表达量为(2.27±2.021)，下调3.30倍(P= 2.021)o RNU17表达与淋巴结转移和EBV感染有关(P<2.25)o在EBVaGC中RNU12的表达量为(2.22±2092)，而相应癌旁组织的表达量为(2.393±2093)，下调3.0倍(P=2.223)。RNU12表达与EBVaGC的TNM分期、淋巴结转移及浸润深度密切相关(P<225)o Kap/q-Meier分析结果显示：在EBVaGC中RNU17高表达组总生存率优于高表达组(P=2.008)o结论RNU12可能是EBVaGC潜在的肿瘤生物学标志物。 关键词：胃肿瘤；疱疹病毒4型；长链非编码RNA；RNU2；预后
中图分类号：R322.44；R735.2文献标志码：A文章编号：1041-7399(2424))1-1294-46
Voi：14.2315//ctb ejeep.2424.11.046
EB病毒(Epstein-Bar r viuis,EBV)属于丫-DNA 线性双链嗜淋巴细胞病毒,EBV与多种肿瘤的发生密切相关，如鼻咽癌、T细胞淋巴瘤及机会性淋巴瘤等J]o近年EBV相关胃癌(Epstein-Baryirns-assocl-ateh yastne carcinoma,EBVaGC)已逐渐被人们认识。采用PCR、DNA原位杂交和EBER原位杂交技术检测胃癌组织中EBV相关的基因，发现EBV与某些胃癌发生、发展紧密相关[2]o2212年Cancar Genoma Atlas Research NetworU正式将EBVaGC作为独立的亚型提出J]O EBVaGC的发生、发展与普通胃癌有差异，但具体机制尚不清楚。IncRNA是一类转录本长度超过220个核苷酸的RNA，参与肿瘤发生、发展、转移等各过程，具有重要的调节作
接受日期：2022-09-22
基金项目：福建省科技厅面上项目(262JU296)、福建省科技创新联合项目(2617Y9082)
作者单位:1福建省中医药大学免疫学与病原生物学教研室，福州306125
5福建省肿瘤医院/福建医科大学附属肿瘤医院放射生物
学及肿瘤放射研究室、病理科，福州330014
作者简介：刘芬，女，硕士，副教授。E-mail：**************林贤东，男，主任技师，硕士生导师，通讯作者。E-mail：
/dxpopvl270@yeah,net 用[「6]0前期IncRNA芯片筛选及数据分析显示IncRNA RNU12在EBVaGC中特异表达[]，但其在EBVaGC作用尚不清楚。本文旨在探讨EBV感染与胃癌的相关性，以及RNU12表达与胃癌临床病理特征、EBV感染的关系，为EBVaGC的、控制和预防提供理论依据。
1材料与方法
14材料选取2212年7月~202年4月福建省肿瘤医院接受胃癌切除的12例胃腺癌患者，其中EBVaGC患者44例。患者男性09例和女性24例，中位年龄为52岁(四分位数间距：22.2~82.2岁)。肿瘤直径中位数为5.5cm(四分位距：1.0~2.0 cm)o按第0版AJCC分期：I期2例，U期26例，皿期64例,W期2例；根据Lauren组织学分型：肠型77例，弥漫型39例。患者手术前未接受任何化疗。肿瘤切除后立即将一部分新鲜肿瘤组织和邻近的非肿瘤胃组织经液氮快速冷冻并于-80C储存，另一部分经2%中性福尔马林中固定，并石蜡包埋。
1.2方法23例胃癌标本采用组织芯片制作机细针打孔的方法，从众多的组织蜡块(供体蜡块)中采集数十至上百个圆柱形小组织(组织芯)，并将其整齐排列于另一空白蜡块(受体蜡块)中，制成组织
芯片蜡块。
12EBV原位杂交检测EBV原位杂交检测采用EBER1检测试剂盒，将组织芯片蜡块切片、烤片、脱蜡、脱水及蛋白酶K消化约5mid，滴加EBV核酸探针(Epstein-Bay eucoZed RNA)杂交液,55C孵育99 min,37C孵育过夜。一抗孵育35min，二抗孵育22 min。洗涤擦干，滴加辣根过氧化物酶反应35min；滴加DAB复合物显，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封固。
12qRT-PCR检测取162mg的冻存新鲜组织液氮环境下研磨成粉末状，加入1mL TVzoi，静置16 min后抽提mRNA。使用分光光度计测定RNA浓度。按照逆转录试剂盒操作说明书将提取RNA逆转成cDNA,-80C保存备用。实时荧光定量PCR 按SyderGreez说明书配制反应体系，反应条件如下：95C16mic；P5C2s、66C22s、77C16s,42个循环；进行熔解曲线检测。每个样本设3个复孔，实验重复3次。以GAPDH为内参基因与各基因表达进行标准化对照，同时以T-Z7392癌组织表达(ca/j bratar)对其他标本进行量化，即它的表达量设为1，量化其他样本的表达量；采用2一法计算相对表达量的RQ值，为了便于统计，把RQ值取lopl6进行分析［］。RNU16上游引物：5'-TGACGCCCGAA TCCTCAC T'；下游引物：5'-ATCGCAACTCCCAGGCA TCT'-GAPDH上游弓|物:5，-CCAGAACATCATCCCT GCCTT；-下游引物：5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'
12统计学分析采用SPSS22.2软件进行统计学分析，计数资料的组间比较采用X2检验，若数据不满足
一般X检验的条件，采用FRher确切概率法进行分析比较；连续型变量配对资料的比较采用配对t检验；两组间的比较先进行正态性检验及方差齐性分析，再进行两独立样本h检验；计量资料以p ±s表示，两组之间均数比较采用t检验；以P< 2.25为差异有统计学意义。
2结果
22EBV感染与胃癌临床病理特征的关系EBV 原位杂交结果显示,93例胃腺癌中,46例EBER阳性，细胞核呈棕褐。EBVaGC多表现为溃疡型或凹陷型肿物，具有淋巴上皮瘤样组织学、中低分化腺癌伴大量淋巴细胞浸润等形态学特点(图1)o EBV 感染与患者年龄、分化程度、Laurez分型及肿瘤大小相关(P<2.25，表1)；与患者性别、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、脉管癌栓及神经侵犯无关(P> 2.05，表1)o
图1胃癌的EBER原位杂交：A.EBVaGC中EBER呈阳性；B.非EBVaGC中EBER呈阴性
表1EBV感染与胃癌临床病理特征的关系
临床病理
参数
EBV
+
X7值
16
39
7
968202196
30
4.57702032
16
39
7
7.34 2.527
57
9
5.421 2.52*
16
30
6.77502009
2
994905163
44
11
2.27705599
35
12
2.45705118
34
2.C22 2.364
30
19
2.271 2.59
27
P值
n
性别
男8950
女2417
年龄(岁)
<626030
$625357
分化程度
低8041
中+高3326
Laurex分型
肠型7740
弥漫型3627
肿瘤直径(cm)
<25640
鼻55727
浸润深度
肌层108
浆膜及浆膜外10359
淋巴结转移
无3019
有8348
TNM分期
I+I3927
皿+W7440
脉管癌栓
宵禁令无4529
有6838
神经侵犯
无4526
有6841
*P<2.22
22胃癌、癌旁组织中RNU12的表达利用qRT-PCR检测119例胃癌及癌旁组织中RNU16的表达
水平，胃癌组织中RNU12的表达量为(0.01 ± 0. 004) (/RQ,RQ =2-AA Cl )，相应癌旁组织的表达量
为(0. 27 ±0. 001)，下调3. 33倍，差异有统计学意
义(P=0. 001，图2)；表明RNU12在胃癌组织中的 表达水平低于癌旁组织。
2
1
o
(o a M)I )*^*w ^v h n r n
CHNDI
P<0.01
・.・A ・
A 胃癌组织
癌旁组织
图2 qRT-PCR 法检测RNU12在胃癌及癌旁组织中的表达：红线表示每组的平均值
2.3胃癌中RNU12表达与临床病理特征的关系
根据胃癌淋巴结转移情况分为转移组和无转移 组，淋巴结无转移组34例,RNU12的平均表达量
0. 27；淋巴结转移组50例，平均表达量为-0. 061,
差异有统计学意义(P=0.011)O 按照EBV 原位杂 交检测分为EBVaGC 和EBV 阴性胃癌，EBVaGC 组
46例,RNU2的平均表达量0. H^BV 阴性胃癌
组67例，平均表达量为-0. 673，差异有统计学意义 (P = 0.025)，表明EBV 感染影响RNU12表达。 RNU12表达与患者性别、年龄，肿瘤部位、肿瘤大
小、浸润深度、分化程度、Lauren 分型、神经侵犯、脉 管侵犯及TNM 分期无明显相关性(P >0. 05，表2)0
2.4 EBVaGC 及癌旁组织中RNU12的表达 通
过EBER 检测分析，23例胃癌患者中有46例为 EBVaGC o 44例EBVaGC 中RNU12的表达量为 (0. 24 ±0. 094) (l g RQ,RQ =2-AA Cl )，而相应癌旁
组织的表达量为(0. 393 ±0. 093)，下调3.0倍，差
异有统计学意义(P=). 023，图3)，提示RNU12在
EBVaGC 组织中的表达水平低于癌旁组织。
2.4 EBVaGC 中RNU12 mRNA 表达与临床病理 特征的关系 将EBVaGC 按照WH0(202)胃肿瘤
组织学进行分类，TNM 分期：I + U 期2例,
RNU12的平均表达量为0. 392 ；m + IV 期34例，平
均表达量为0.000 ，两者间差异有统计学意义(P < 0. 05) O 按淋巴结转移分组：淋巴结无转移组2例,
RNU12的平均表达量0. 533；淋巴结转移组35例,
表2胃癌中RNU12表达与临床病理特征的关系
临床病理参数n RNU12 表达量(lgRQ )
值
性别男
09
4.423 ±4.442
4.266
女24-4.007 ±4.436年龄(岁)
<64
62 4.041 ±2.023 4.936
三64
53
-4.042 ±2.024
分化程度
投入产出法高86-4.021 ±4.252 4.447
低33
4.447 ±4.442
浸润深度
<T2
2 4. 27 ±4.456 4. 23
三T2
23-4.012 ±4.443Lanreu 分型
肠型77
-4. OH ±4.040 4.544
弥漫型
36
4.435 ±4.431肿瘤直径(cm )
<5
52 4.013 ±4.445 4.646
三3
57
-4.012 ±4.433
TNM 分期I + U
39 4.499 ±4.469
4. 12
皿+ V 74-2.053 ±4.449
淋巴结转移无转移34 4. 27 ±4.40有转移03-4.061 ±4.445
4.011 *
神经侵犯无
47
-4.012 ±4.462 4.374
神意太极拳有60 4.049 ±4.443
脉管侵犯无
47
4.431 ±4.456 4.077
有
60-4.022 ±4.421
EBER 感染
无67
-4.077 ±4.454
4.425 *
有
46 4. 20 ±4.463
P<4. 45
(0
出曰)*
M *
EBWGC 组织
癌旁组织
图 6 qRT-PCR 法检测 RNU12 在 EBVaGC 及
癌旁组织中的表达：红线表示每组的平均值
平均表达量为-0. 022，两者间差异有统计学意义 (P=0. 006) o 按浸润深度：<；丁2组2例，RNU2的
平均表达量0.779，三T2组44例，平均表达量 0. 077，差异有统计学意义(P=0. 001)，表明RNU12
表达与EBVaGC的TNM分期、淋巴结转移及浸润深度有关。RNU12表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、Lanez分型、神经侵犯及脉管侵犯无明显相关性（P>0.05，表3）o
表3EBVaGC中RNU12表达与临床病理特征的关系
临床病理参数n RNU14表达量（ORQ）P值
性别
男3901147±0.499
0.648
女7-0.402±0.401
年龄（岁）
<64340.253±0.434
0.245
160.411±0.417
分化程度
高390.295±0.491
0.535
低70,19±0.285
浸润深度
<T220.577±0.417
0.401*
$T2440.477±0.491
Laurez分型
肠型370.144±0.295
0.932
弥漫型90.140±0.452
肿瘤直径（cm）
<5160.436±0.147
0.171
$5340.414±0.149
TNM分期
I+I140.392±0.172
0.450*
皿+IV340.408±0.434
淋巴结转移
无110.535±0.172
0.406*
有35-0.426±0.496
神经侵犯
无190.435±0,177
0.469
有270,172±0,144烟台的海教学设计
脉管侵犯
无160.239±01143
0.436
有340.433±0,114
P<0.05
2.2RNUH表达与预后的关系46例EBVaGC 组织中RNU12的相对表达量lgRQ符合正态分布，故取中位数0.074将其分为高表达组（24/78）和低表达组（22/78）。RNU12高表达组24例，死亡5例（20.8%），平均生存时间（64±22.0）个月；RNU12 低表达组22例，死亡9例（52.2%），平均生存时间（39.2±6.8）个月。采用Kaulau-Meiov分析法绘制生存曲线，结果显示RNU12高表达组总生存率高于低表达组（P=0.008，图4）o
3讨论
EBV属于疱疹病毒具有长约134kb的双链
图4胃癌患者预后生存分析
DNA结构，内编码大于85个基因组。EBV与其他疱疹病毒类似，有一个环形蛋白核心，外面由双链DNA包绕。EBV感染人体后可引起体液免疫和细胞免疫，却能够逃避机体的免疫监视和攻击的机制及其致癌特征⑼。EBV是第一个被发现与人类肿瘤发生有明确联系的病毒，长期感染可引起鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和T细胞淋巴瘤等恶性肿瘤［10］o研究表明，EBV 也是重要的胃癌致病因子⑴。EBVaGC约占胃癌的14%，预计每年新增的EBVaGC有80000多例7］。2014年Cancer Gezomo Atlas Research Network3.对225例胃癌的综合性分子分析及数据整合研究，提出新的胃癌分子分型方法，将胃癌分为4个亚型: EBVaGC、微卫星不稳定型、基因组稳定型、染体不稳定型，正式将EBVaGC归为独立的亚型。本实验显示EBV感染与患者年龄、组织分化.Laurez'分型、肿瘤直径密切相关。研究表明，EBVaGC具有独特的生物学行为，包括PIK3-BA通路突变、DNA 超甲基化、PDT1和PD-B2基因拷贝数增加等分子特征⑶。以上结果提示，EBV可能在胃癌发生、发展中扮演重要角。
lucRNA指长度在200个核苷酸以上且不能编码蛋白质的RNA o IncRNA是近年研究热点，作为关键调控分子参与基因调控，涉及表观遗传、转录及转录后，主要作为信号分子（signa-［、诱饵分子（decay）、引导分子（alyde）、支架分子（scaffold）在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用〔⑴。IncRNA与胃癌的研究也备受关注，在胃癌中发现IncRNA LEIGC 在癌组织中的表达量低于癌旁和正常组织，过表达LEIGC通过上调E-cadherin，下调vimeutic及EMT
相关转录因子进一步抑制EMT过程，从而抑制胃癌细胞的侵袭转移能力［2］。IncRNA PVT1与FOXM1相互作用，促进胃癌细胞的增殖和侵袭，可能成为胃癌的预后标志物及药物靶点［6］。本实验表明RNU12在胃癌组织与癌旁组织中表达水平有显著差异(P<5.05)，且其异常表达与淋巴结转移及EBV感染密切相关，进一步证明IncRNA异常表达在胃癌的发生、发展中起重要作用。
EBV调控的宿主IncRNA在上皮性癌中发挥重要作用「⑷。几乎所有鼻咽癌患者中均发现持久性潜伏EBV感染。Li等［15］通过NGS测序技术分析7例鼻咽癌组织和7例正常鼻咽组织的IncRNA表达，结果显示：212个IncRNA异常表达，且涉及EBV感染相关的62个IncRNA反式调控基因。LIAC09314也称为鼻咽癌相关基因7，具有抑癌基因的作用。LINC00312与鼻咽癌中由EBV转录的非编码RNA EBERP呈高度负相关。LINC00312可以限制鼻咽癌细胞的增殖，并阻止其在细胞周期中从G1期发展到S期，从而加剧细胞凋亡。LIAC09314的表达与鼻咽癌的淋巴结转移呈负相关［6］。以上结果表明，EBV调控的宿主IncRNA在鼻咽癌中起重要作用。Wang等［12］在EBVaGC研究中也发现,EBV感染可导致宿主IncRNA表达失控。本课题组前期分析表明，小核仁RNA宿主基因8 (small nacleolae RNA host/exa8,SNHG8)在EB-VaGC的表达明显高于在非癌性胃黏膜细胞或EBV 阴性胃癌组织中的表达。EBVaGC中SNHG8的表达与TNM分期显著相关［］。进一步研究表明，SNHG8与EBV基因相互作用，包括BHLF1、LF3、BHRF1和BNLF2/。Huang等［］推测SNHG8可以调节TRIM28、EIF4A2、NAP1L1PLD3、RPL1A和TRPM7的表达，可能对胃癌的发生有直接影响。RNU12是本课题组筛选的另一个与EBVaGC相关的长链非编码RNA o
RNU12在疾病及肿瘤中作用仅有少量文献报道。RNU12基因突变引起早发性小脑共济失调［5］。肝癌中研究发现RNU1可在转录水平上调控HSP72表达，进而抑制重组人TRAI蛋白诱导的肝癌细胞凋亡。本组在前期工作和分析的基础上，重点探讨RNU1在EBVaGC中的作用。EBVaGC 中RNU1在癌与癌旁组织表达差异有显著性(P< 5.05)，且RNU12异常表达与TNM分期、淋巴结转移及浸润深度密切相关。Ka/1/a-Meive分析RNU1表达与EBVaGC患者预后，结果显示:RNU12低表达组患者总生存率比高表达组患者预后差(P= 5.098)o以上结果表明，RNU1在EBVaGC发生、发展中起重要作用，可能是独立的预后指标。
综上所述,RNU1的表达水平与EBVaGC临床病理特征及预后密切相关。EBVaGC是胃癌的特殊类型，其形态学特征及基因变化与其他类型的胃癌有差异，目前相关分析仍较少。本课题组将积累更多病例进行功能和机制分析，明确RNU12在EBVaGC的作用，为、控制和预防EBVaGC提供参考。
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