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瞬时速度中心
文章编号：1007 —4287(2020)12—1946 —08
SUNE-1辐射敏感性的影响
金爱燕，李立萍，朱虹，高春成，左文娜，王洪芹
(沧州市中心医院耳鼻喉科，河北沧州061000)
摘要：目的探讨长链非编码RNA PC G E M l(L nc RNA PCGEM1)对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响。方法收集60例经放射失败的鼻咽癌患者癌组织及距离癌组织超过2c m处的正常组织，q R T-P C R检测Lnc RNA PC- G E M1在鼻咽癌及正常组织中的表达情况，并分析其与临床病理特征的相关性；构建Lnc RNA PC G E M1沉默细胞系
SU N E-：K s iP C G E M l及阴性对照SU NE-1-N C，并以S U N E-1作为空白对照；电离辐射后，采用M T T及平板克隆实验、T nm sw ell、划痕实验、免疫荧光标记检测Lnc RNA P C G E M1对S U N E-1细胞辐射敏感性、侵袭能力、迁移能力及
D N A损伤修复的影响；使用生物信息学网站starB ase预测P C G
E M1可互补结合的微小R NA(m icroR N A，m iR N A)，
双荧光素酶报告基因实验进一步检测两者的相互作用，qR T-P C R测定S U N E-1细胞中m iR148a的表达。结果鼻咽癌组织中Lnc RNA P C G E M1的表达水平高于癌旁正常组织，且差异有统计学意义（P<0.05)；分化程度越低，临床 分期越晚，淋巴结发生转移的患者lnc RNA P C G E M1表达水平越高，差异具有统计学意义（P<0.05)；与空白对照组和S U N E-1-N C组相比，S U N E-1-siP C G E M l组细胞辐射后细胞增殖、侵袭和迁移能力明显下降，7H2A X荧光强度明显增加，差异均具有统计学意义（P<0.05)，空白对照组与S U N E-l_N C组相比，差异无统计学意义（P>0.05);Star-
B a s e网站预测结果显示，Lnc RNA P
C G E M1可与miR-148a互补结合，双荧光素酶报告证实Lnc RNA P C G E M1与
miR-148a存在靶向作用关系；q R T-P C R结果显示S U N E-1-siP C G E M l组中m iR148a表达明显低于空白对照组与S U N E-h N C组（P<0.05)。结论Lnc RNA P C G E M1在鼻咽癌中呈高表达，沉默Lnc RNA P C G E M1表达可能通过上调m iR-148a水平增加鼻咽癌细胞辐射敏感性。
关键词：Lnc RNA PC G E M l;m iR-148a；鼻咽癌细胞；辐射敏感性
中图分类号：R739.6 文献标识码：A
Effects of Lnc RNA PCGEM1 on SUNE-1 radiation sensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells J I N A i-y a n,L I Li-pi?ig Z H U H ung yet a l. {Department o f Otolaryngology ^Cangzhou Central H ospital •,Cangzhou061000»C/i/?2a) Abstract ： Objective To investigate the effects of long non-coding RNA P C G E M l(L n c RNA PCGEM1) on the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells. Methods Cancer tissues and normal tissues more than 2cm away from the nasopharyngeal carcinoma in 60 patients with failed radiotherapy were collected. The expression of Lnc RNA PC- GEM1 in nasopharyngeal carcinoma and normal tissues was detected by qR T-PCR,and its correlation with clinicopatho- logical characteristics was analyzed. The Lnc RNA PCGEM1 silent cell line SU N E-l-siPC G E M land the negative control SU N E-l-N C were constructed,and SUNE-1 was used as the blank control. After ionizing radiation, the effects of Lnc RNA PCGEM1 on the radiation sensitivity, invasion ability, migration ability and DNA damage repair of SUNE-1 cells were detected by M T T, Trans w ell, scratch test and immunofluorescence labeling. Bioinformatics website starBase was used to predict PCGEM1 complementary binding microRNACmicroRNA, miRNA) and double luciferase reporter gene experiments to further detect the interaction between the two. QRT-PCR was used to determine the expression of
中国实验诊断学2020年12月第24卷第12期1947
miR-148a in SUNE-1 cells. Results The expression level of Lnc RNA PCGEM1 in nasopharyngeal carcinoma tissues was higher than that in adjacent normal tissues,and the difference was statistically significantCP<C0. 05). The lower the differentiation degree,the later the clinical stagehand the higher the expression level of LNC RNA PCGEM1 in patients with lymph node metastasis, the difference was statistically significant (P<10. 05). Compared with the blank control group and the SU N K-1-NCgroup, the cell proliferation, invasion and migration ability of the SU NE-1-siPC GEM lgroup decreased significantly after radiation,and yH2AX fluorescence intensity increased significantly, with statistically significant differencesCP<C0. 05). There was no significant difference between the blank control group and the SU NE-l-NC- group(P>-0. 05). According to the prediction results of starBase website,Lnc RNA PCGEM1 can complement and bind with miR-148a. The report of double lucigenase confirmed the targeting relationship between Lnc RNA PCGEM1 and miR-148a. QRT-PCR results showed that the expression of miR148a in the SUNE-1-siPCGEMlgroup was significantly lower than that in the blank control group and the SU N E-l-NCgroup( P<0.05). Conclusion Lnc RNA PCGEM1 is highly expressed in nasopharyngeal carcinoma,and silencing the expression of Lnc RNA PCGEM1 may increase the radiation sensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells by upregulating the level of miR-148a.
Key words：Lnc RNA PCGEM1 ； MiR-148-a； Nasopharyngeal carcinoma cells；TRadiosensitivity
伦敦证券交易所
(C h in J Lab2020,24：1946)
灰空间鼻咽癌是头颈部最为常见的肿瘤类型，发病率 逐年递增，具有隐匿性强、进展缓慢的特点[1]。大多 数晚期鼻咽癌患者经放射后仍会复发或转移[2]。文献报道[3]，鼻咽癌的发生和癌基因的活化表达相关，因此揭示鼻咽癌相关的基因和调控机制对鼻咽癌具有极其重要的意义。长链非编码R N A(l o n g-c h a i n noncoding R N A.l n c R N A)曾被 认为不发挥实际作用，近年来有研究发现，其在肿瘤 细胞周期、肿瘤细胞侵袭转移与化疗耐药等相关的信号通路方面均发挥调节作用[4]。作为l n c R N A 家族成员之一，非编码R N A(a n t i-d i f f e r e m i a t i o n noncoding RNA,Lnc R N A)P C G E M1 已被证实在 多种疾病的发生发展过程中具有分化调控的作用[5]。鼻咽癌的发生发展中有诸多非编码R N A、抑 癌基因、促癌基因及蛋白因子的参与，但目前关于P C G E M1在鼻咽癌中的作用研究报道甚少，其是否 能够调节鼻咽癌细胞的放疗敏感性尚不清楚。因此，本研究通过对鼻咽癌组织和细胞株的研究.探讨 P C G E M1对鼻咽癌细胞辐射敏感性的分子机制，为新型靶向药物的研发提供理论依据。
1材料与方法
1.1 组织标本
收集2016年1月-2018年6月经放射失败 后于我院接受手术的95例鼻咽癌患者癌组织 及距离癌组织超过2 c m处的正常组织，用以上组织 构建鼻咽癌组织芯片.在免疫组织化学染后共15 例组织标本出现不同程度缺失.剩余80例标本经组 织病理学检测证实为原发性鼻咽癌，并纳人研究，患 者年龄38-72岁，中位年龄51岁。所有患者均同意 本研究并签署知情同意书，且经我院伦理委员会审核批准后收集标本。
1.2细胞及主要试剂和仪器
鼻咽癌细胞株S U N E-1购自美国模式培养物保藏所（A T C C),S i P C G E M l及阴性对照n e t a t i v e control(N C)干扰片段，miR148a、PC G E M l及 U6 引物均由上海吉玛制药技术有限公司设计完成。
D M
E M培养基（D777) ;SYBR Green 荧光定量 PCR 检测试剂盒（Q P K-201)于T O Y O B O采购；X射线 生物辐照仪购自 Thermo;T r i z o l reagent (9009)采 购自TaKaRa;Transwell小室采购自B D;M T T试 剂盒购自碧云天；7H2A X、T G F、S m ad抗体购自博泰恒通。苏净Airtech超净工作台；S A N Y O M C O 15A C细胞培养箱；Nikon Ti-U/Ti-s倒置荧光显微 镜；5810R型高速离心机；Roche R480实时荧光定量P C R仪。
1.3细胞转染
调整鼻咽癌细胞株S U N E-1细胞株浓度至1X 106个/ml，取2 m l接种于6孔板中，培养过夜.采用 Lipofectamine 2000 将浓度均为100 nmol/L 的siPCGEMl和阴性对照转染至细胞.以S U N E-1作 为空白对照，得到S U N E-1-siPCGEMJ及S U N E-1- N C细胞株。
1.4 qRT-PCR检测 Lnc RNA PCGEM1 的表达
采用Trizol法提取各组细胞总R N A并进行反 转录，按照PrimeScrip反转录试剂盒进行反转录成c D N A，采用SYBR Premix Ex T a q说明书配置P C R反应体系，反应条件为：95C预变性10 min.然 后 95‘
C 10 s，6(TC 30 s，72’
C 10 s，40 个循环；95t
5 s，6(TC 1 min，95X； 30 s。U6作为内参（上游引物 为 5 ’-C T C G C T T C G G C A G C A C A-3 ’，下游引物为
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Chin J Lab D iagn,D ecem ber,2020,Vol 24,No. 12
进行免疫荧光检测.将细胞贴附于载玻片上，PBS 清洗后，4%多聚甲醛固定室温下固定15 m m ，再经0.1丁出〇11\-100室温通透细胞20〇1丨11,2%羊血清 室温封闭1 h，加人7H 2A X —抗，41：下孵育过夜， 再加人二抗室温孵育1 h ，经D A H 核染后共聚焦 显微镜拍照并记录细胞中绿7-H 2A X foci数量。 1.9生物信息学预测
使用生物信息学网站starBase预测P C G E M 1 可互补结合的微小R N A (microRNA，m i R N A )。 1.10荧光素酶基因报告分析
通过imRBase数据库获得人的P C G E M 1基因 序列，以H N E C 细胞基因组D N A 为模板，采用 P C R 扩增P C G E M 1的3'-非翻译区序列，构建至荧 光素酶报告基因载体p s i -C H E C K 中，记为野生型 IncRNA P C G E M l -wild，同时构建突变型重组质粒 IncRNA P C G E M l -mutant。将 H E K 293T 细胞按 30%左右密度铺24孔板，将m i R NA -148a mimic及 mimic contro丨分别与空载质粒、野生型IncRNA PCGEMl-wild 及突变型 IncRNA PCGEM]-mutant 共转染至H E K 293T 细胞，分为空白组、野生组和突 变组。转染后24 h ，根据双荧光素酶测定试剂盒说 明书检测荧光素酶活性。1.11统计学分析
数据统计采用SPSS 19. 0软件，作图工具采用 G r a phpad5.01，两组间比较采用z检验，多组间比较采 用单因素方差分析•■?<〇. 05表示具有统计学意义。2
77se结果
2. 1 Lnc RNA PCGEM 1在不同组织中的表达
R T F Q -q P C R 结果显示，鼻咽癌组织中Lnc R N A P C G E M 1的表达水平高于正常组织，差异有 统计学意义（P <〇. 05)，见图1。
2 On
P(0. 05
图1 Lnc RNA PCGEM1在不同组织中的表达
2.2 Lnc RNA PCGEM 1表达与鼻咽癌患者临床病 理特征的相关性
5 ’ A A C G C T T C A C G A A T T T G C G T -3，），Lnc R N A P C G E M 1 (上游弓| 物为 5，-A C T G T C T C C C A A C - C C T T G T A -3 ’，下游弓| 物为 5 ’-G T G C A G G G T C - C G A G G T -3’），miR-148a (上游引物为5’-八0丁- G T C T C C C A A C C C T T G T A -3 ’，下游引物为5，- G T G C A G G G T C C G A G G T -3 >), miR-148a (上游引 物为 5 ’-C C C A A C C C T T G T A A C T G T C T -3 ’，下游 引物为 5 ’-T C C G A G G T G T G C A G G G -3 ’），相对表 达量用2_AArr 表示。每个样本独立重复实验3次。1.5 M T T 实验检测细胞增殖
细胞 S U N E -1、S U N E -1-NC 及 S U N E -1-siPC- G E M 1经 5 G y 电离辐射照射后，按照每孔500- 1000个密度铺至96孔板，轻轻混匀后，置入37 C 培 养箱继续培养，每孔加M T T 溶液20 y ，37 C 避光4 h 后，弃掉孔内液体，再加D M S ()各100 ^1，置于 37 C'摇床上快速振荡15 min，以便充分溶解结晶 物，最后将96孔板置于酶标仪上检测492 n m 处的 ()D 值。
1. 6 Transwell 实验检测细胞侵袭
实验前12 h 更换为无血清培养基，细胞 S U N E -1、S U N E +N C 及 S U N E -1-siPCGEMl 经 1〇
G y 电离辐射照射后，将40 p i matrigel基质胶铺 于Transwell小室中，消化细胞并用lx P B S 清洗2 遍.将500
完全培养基加人24孔板，细胞计数,
取5 X 10：细胞重悬，向Trans well小室中加200- 250丨J 细胞悬液•保证下层完全培养基与Transwell 小室间无气泡。置于培养箱内正常培养24 h ，加用 甲醇配制、P B S 稀释的0. 1%结晶紫染液500 pi进 行染，室温避光15 min.P B S 漂洗后用棉棒擦Tr- answell小室内部.倒置晾干，置于倒置荧光显微镜 下观察显穿过膜的细胞并拍照计数。1.7划痕实验检测细胞迁移
实验前12 h 更换为无血清培养基，细胞 S U N E -1、S U N E -1-NC 及 S U N E -1-siPCGEMl 经 10 G y 电离辐射照射后，调整细胞浓度，以5X 104 个/孔接种于24孔培养板中.用10 j u l s t e r i l e p i p e t t e 头沿直线做划痕，加入1〇〇 W P B S 将细胞碎片冲 洗掉，然后无血清培养基，37°C 、5%C ()2温箱培养， 分别于〇 h 和24 h 在倒置显微镜下观察细胞运动 情况以及划痕宽度.计算细胞迁移的距离和细胞迁 移率。
1.8 免疫荧光标记
细胞 S U N E -1、S U N E -1-NC 及 S U N E -1-siPC- G E M 1经10 G y 电离辐射照射后，分别于0 h 、6 h
馨
—00-.
V N H 3
3
中国实验诊断学2020年12月第24卷第12期1949
统计收集的80例鼻咽癌患者的临床病理资料. 分析临床病理特征与I n c R N A P C G E M1表达的相 关性，以所收集数据总体水平的70%作为I n c R N A P C G E M1高、低表达水平的分界线，结果显示I n c R N A P C G E M1表达水平与患者性別、年龄、肿瘤直 径无关（P>〇. 05)，分化程度越低，临床分期越晚. 淋巴结发生转移的患者I n c R N A P C G E M1表达水 平越高，差异具有统计学意义（P C O.05)，见表1。
表I Lnc RNA PCGEM1表达与鼻咽癌患者临床病理特征的相关性
临床病理学特征
Inc RNA PCGEM12
P 高表达（n = 58)低表达（n = 22)
X
性别
男2819(67. 86)9(32. 14)0. 0010. 977女5239(75.00)13(25.00)
年龄
<45岁3223(71.88)9(28.13)0. 0970. 756 >45岁4835(72.92)13(27.08)
肿瘤直径
<2cm3525(71.43)10(28. 57)0. 0360. 850 ^2cm4533(73.33)12(26. 67)
分化程度
高分化2614(53.85)12(46. 15)7. 1660. 028中分化3225(78.13)7(21.88)
低分化2219(86.36)3(13.64)
T N M分期
I +E期3923(58.97)16(41.03) 6. 9830. 008
D I + IV期4135(85.37)6(14.63)
胶体金法淋巴结转移0
有4537(82. 22)8(17. 78) 4. 8760. 027无3521(60.00)14(40.00)
2.3细胞系构建
qRT-PCR 结果显示 S U N E-1 组和 S U N E-1-NC 组Lnc R N A P C G E M1的表达无统计学意义（P> 0.05)，S U N E-l-siPCGEMl 组细胞中Lnc R N A P C G E M1的表达量明显低于空白对照组和阴性对照组，差异具有统计学意义（P<〇. 001)，提示成功 构建P C G E M1沉默细胞系，见图2。
图2 各细胞中Lnc RNA PCGEM1相对表达量
2. 4 Lnc RNA P C C E M1对鼻咽癌细胞株SU N E-1辐射敏感性的影响
M T T实验结果显示，与S U N E-1组和S U N E-1-N C组相比，S U N E-l-siPCGEMl组经电离辐照后()
D492 n m值明显下降.差异有统计学意义（P< 0.05)。说明Lnc R N A P C G E M1被沉默后，能增强 鼻咽癌细胞S U N E-1的辐照敏感性，见图3。
时间(d)
图3 M TT法检测Lnc RNA PCGEM1对SU N-1放射敏感性 的影响
场强注：与S U N E-1比较，’f^O.O S；与S U N E-1-NC 比较.5P<0. 05
2.5 L nc RNA P C G E M丨对电离辐照诱导的鼻咽癌细胞株SU N E-1
侵袭能力的影响
1950
Chin J Lab D iagn,D ecem ber ，2020, Vol 24，No. 12
SUN-l-NC
SUN-l-siPCGEMl
图5 Lnc RNA PC G E M 1对电离辐射诱导S U N E -I 迁移能力的影响
图4 Lnc RNA PC G E M 1对电离辐射诱导SUNE-1侵袭能力的影响
2.6 Lnc RNA PCGEM 1对电离辐照诱导的鼻咽癌 细胞株SUNE -1迁移能力的影响
细胞划痕实验结果，相比SUNE -1组和SUNE-
1-N C 组，电离辐照后，SUNE-1-siP C G E M l 组细胞
迁移率明显降低，差异具有统计学意义（•？<0. 05)。 该结果表明沉默Lnc R N A P C G E M 1后，抑制鼻咽 癌细胞电离辐射后的迁移能力，见图5。
Oh
24 h
SIN-1
60
T m n s w e ll 实验显7K ，相比SUNE -1组和 SUNE-1-NC 组，电离辐照后，SUNE-1-siPCGEMl
细胞通过m atrigel 基质胶的数量明显减少，差异具
有统计学意义（P <〇. 05)。该结果表明沉默Lnc R N A P C G E M 1后，抑制鼻咽癌细胞电离辐射后的 侵袭能力，见图4。
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SUNE-1
SUNE-l-NC
SU N E -卜 s iPCGQJl
K 0. 05
K 0.05
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嫌維汩驾思
1
^
2.7 Lnc RNA PCGEM 1对鼻咽癌细胞株SUNE -1 电离辐射诱导D N A
损伤的影响
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