【摘要】 目的:用两种不同的免疫组化方法二步法和三步法分别在胃癌组织中进行ERα-36染结果的比较，寻求不同免疫组化原理的染试剂盒对实验结果的影响。方法： 利用两种不同的试剂盒研究相同的胃癌微阵列芯片（共352点，以肝组织作为定位标志），通过比较两种免疫组化方法在相同组织上表达的不同做比较。结果： 三步法制片结果比二步法背景低，阳性率低，非特异性着小，结果明确易读；而二步法较三步法操作简单，检查阳性率高，阳性强度高。结论： 针对一抗为ERα-36的免疫组化染，三步法虽然实验耗时比较长，但实验结果较好，明确易读，适合科学研究。二步法较易出结果，灵敏度较高，阳性强度高，较易出背景着，假阳性率高，故不适于科学研究，但因为操作方便，检出阳性率较三步法高，对于ERα-36弱表达的病例不容易漏诊，且能较快出结果，故可考虑在临床病理诊断中选择应用。 【关键词】 免疫组化技术; 二步法; 三步法； 组织芯片技术
免疫组织化学技术是利用已知的特异性抗体与抗原的特异性结合来检测组织或细胞内某种物质的性质，并利用酶作用于底物所产生的颜反应来显示某种物质的分布于细胞内定位的一 种技术，自建立免疫酶标技术以来，这门技术得到了迅速发展，在科研和临床诊断已被广泛应用。研究发现部分胃癌为雌激素受体依赖性［1］。但一张好的免疫组化切片需要真阳性染结果表达在预期对应的组织细胞中，定位清晰准确，间质清楚，无或少背景着［2］。影响免疫组化的结果有很多，如组织固定、脱水的过程、修复的好坏以及免疫组化的过程和免疫组化试剂盒的选取以及显步骤均对结果有影响［3］。目前研究影响免疫组化结果的因素多从免疫组化试剂盒以外几方面分析，对不同原理的试剂盒对实验结果的影响研究甚少。本研究拟以ERα-36为目的指标，观察免疫组化两步法和三步法在ERα-36检测中的异同，探讨两种方法在使用中的优缺点。
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1 材料和方法
1.1 材料
由江汉大学肿瘤教研室构建352点胃癌组织芯片，以正常肝组织作为定位标记，芯片直径0.6�L，片厚4ｕm。
ERα-36兔抗人多克隆抗体，由Creighton大学王兆一教授提供，以胞浆着为阳性。三步
法SP超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，二步法PV-9000试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。
1.2 方法
选用已知阳性的正常乳腺组织为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显，染步骤严格按说明书进行。苏木素复染核。
以三步法为例，具体操作如下：
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① 石蜡切片常规脱蜡至水化，用PBS（pH 7.4）冲洗3次，每次3min；
② 用EDTA缓冲液浸泡(pH 8.0)，高压修复2min，使抗原暴露；
③ 每张切片加150μl过氧化酶阻断溶液（试剂A），室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3min；
④ 除去PBS液，每张切片加150μl正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育10min；
⑤ 除去血清，每张切片加150μl的第一抗体，4℃过夜；
⑥ PBS冲洗3次，每次3min，除去PBS液，每张切片加150μl生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10min， PBS冲洗3次，每次3min；
⑦ 除去PBS液，每张切片加150μl链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液（试剂D），室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min；
⑧ 除去PBS液，每张切片加600μl的新鲜配制的DAB，显微镜下观察3～10min；
alphabetic writing system ⑨自来水冲洗，苏木素复染 ，自来水冲洗返蓝或冲洗后用PBS快速返蓝；
⑩ 梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
两步法④至⑦步骤与三步法不同，不用正常血清封闭，直接滴加一抗过夜，然后直接滴加聚合了辣根过氧化物酶的特异性二抗，余步骤相同。
1.3 统计学处理
采用卡方检验，所有统计学采用SPSS13.0完成，P＜0.05为差异有显著意义。
2 结果
采用免疫组化三步法对胃癌组织芯片ERα-36进行处理后的染结果均为浆着，无核表达。染结果为癌组织显示棕黄的颗粒，背景清晰。根据芯片上显结果的深浅我们对其进行了4个等级的评定：癌细胞胞浆无着-;癌细胞胞浆上出现淡黄染颗粒+;癌细胞的胞浆上出现深棕黄的染颗粒为+++；介于+与+++之间染深度为++。ERα-36的阳性率为(52/111)46.85%，其各个等级表达率见表1。
采用免疫组化二步法对胃癌组织芯片ERα-36分别进行处理后，阅片标准同三步法。结果均为浆着，无核表达。ERα-36的阳性率为(105/111)94.59%，其各个等级表达率见表1。表1 二步法与三步法阳性率的比较由表1可见，二步法与三步法各个等级免疫组化ERα-36的阳性率存在显著差异，两步法高于三步法。
此外，我们通过使用二步法和三步法对ERα-36进行染发现，三步法检测结果的背景较二步法低，非特异性着小，检查出的阳性率低于二步法，且费用相对较少；但二步法步骤少，耗时较少，且无内源性生物素的干扰，检出的阳性率高，染强度高，见表2。表2 二步法与三步法比较
3 讨论
关于胃癌的ER阳性率国外报道为23%（30/130）(免疫组化法)［4］，国内外多项研究发现ERα-36在胃癌中表达。
二步法又称非生物素酶法。该方法中的第二抗体是将特异性的抗体和辣根过氧化物酶通过一个多聚糖骨架联接成一个多聚体。PV系列二步法免疫组化检测试剂将二抗抗体分子和酶聚合在氨基酸骨架上，形成多聚体，替代传统方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体结合的信号，避免再使用生物素。然后通过DAB呈反应来观察抗原表达部位。
三步法又称生物素酶法。我实验室采用SP超敏试剂盒是根据链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（Streptavidin-Peroxidase）链接系统设计的。第二抗体采用生物素标记；链霉菌抗生物素蛋白（SA）是从链霉菌中分离出的蛋白质，分子量为60KD，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotion）连接的部位，且两者之间有很强的亲和力。SA与过氧化物酶形成SA-过氧化物酶复合体；生物素化的二抗与SA-过氧化物酶复合体，可通过DAB的呈反应来显示抗原抗体结合部位。
我们对芯片的染结果进行比较和讨论，发现用三步法进行染的芯片结果明确易读，而二步法阳性率普遍较高，非特异性着率高。
免疫组化三步法染非特异性着率比二步法低的原因可能是:①三步法加一抗前用血清封闭去掉内源性杂质的干扰， 而PV二步法省了这一步，因此SP三步法非特异性着率低；②二步法灵敏度高，第一抗体4℃过夜容易导致背景着。因此，三步法的假阳性率（假阳性指所有切片均呈阳性反应，或一组抗体均在同一组织细胞的胞质或胞核呈阳性反应，另外切片边缘、刀痕，皱褶区和挤压区呈现的阳性反应）［5］低于二步法，故对于实验室研究检测ERα-36的阳性表达率适合采用三步法以避免误差。但是三步法耗时较长，步骤较多，对操作人员要求较高，且对于阳性表达率较低的病例不容易检出，故在这方面二步法比较有优势，二步法法灵敏度较高，不容易漏诊，且无内源性生物素的干扰，DAB显较快，顾较适合临床快速诊断使用。我实验室研究的是胃癌上一抗为雌激素受体ERα-36时的染结果，对于检测其它指标二步法和三步法检测结果是否也有显著性差异还有待于进一步研究。
【参考文献】
1 Nicolson GL. Cancer metastasis : tumor cell and host organ properties important in metastasis to specific secondary sites.Biochim Biophys Acta ，1988 ，948（2） :175~224.
麦大成
2 张铭，司少艳，韩瑞刚，等. 免疫组化SP法与PicTureTM两步法的比较. 诊断病理学杂志，2004，11 (1):58~59.
3 刘桦，赵静.病理免疫组化染方法质量控制应注意的基本问题.中国煤炭工业学杂志，2006，9(12):1246~1247.
4 Kojima O ，Takhashi T ，Kawakami S， et al. localization of estrogen receptors in gastric cancer using immunohistochemical staining of monoclonal antibody cancer ，1991 ，67（9） : 2401~2406.
5 李向红.医学实验室标准化的方向.中华病理学杂志， 2004，33（6）:591~592.八卦养生法
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